RESUMEN - HEMATOLOGÍA Y CITOLOGÍA (dedicado a Miren Cárcamo)

 RESUMEN DE HEMATOLOGIA Y CITOLOGIA

MATERIALES DE LABORATORIO

Materiales de uso en el laboratorio

1. El Vidrio - tiene una gran resistencia quimica (acidos, bases), mecanica y estabilidad termica; vidrio de borosilicato (Pyrex, Kimax) - gran resistencia termica.

Precauciones: cambios bruscos de temperatura / tensiones termicas; colocar en la estufa de secado o esterilizacion en frio, calentando despues, acabado en tiempo de secado o esterilizacion ==> dejar enfriar antes de retirarlo; no aplicar fuerza sobre llaves, tapones; no someter a variaciones bruscas de presion; no conservar soluciones concentradas de alcalis en vidrio de borosilicato ==> condiciones causticas destruyen la calibracion del vidrio.

2. El plastico - de usar multiple (probetas, matraces, vasos de precipitado); de un solo uso / desechables (puntas de pipeta, placas de petri, cubetas de espectrofotometro); las ventajas - resistencia a la rotura y su bajo peso; hechos de monomeros organicos polimerizados; desventaja: no soportan temperaturas elevadas, pueden ser atacados por disolventes organicos y acidos o bases fuertes.

3. La porcelana - resisten altas temperaturas y tiene un gran uso en analisis gravimetrico; estan vidriados totalmente o por su parte interna para evitar la adherencia de particulas a sus paredes.

Material Volumetrico - Mediciones de Volumen

Todo el material volumetrico esta calibrado para ser utilizado de una forma determinada y a una temperatura estandar (20oC); volumen ocupado por una determinada masa de un liquido varia con la temperatura.

Instrumentos volumetricos con sus tipos de calibracion:

- Instrumentos calibrados para verter (vert, Ex o TD): pipetas, buretas (la cantidad de liquido que permanece adherido a la pared del vidrio, debido a la humectacion, se ha tenido en cuenta al realizar la calibracion.

- Instrumentos calibrados para contener (cont, In o TC): matraces aforados (la cantidad de liquido vertido se encuentra reducida en la cantidad de liquido que permanece adherida a la pared del vidrio.

Error de paralaje - desplazamiento aparente de un objeto cuando se observa desde diferentes puntos debido a un defecto de posicion del operario. Al leer el volumen, el ojo debe estar al mismo nivel que el menisco/ marcada curvatura (por encima de menisco = volumen menor; por debajo de menisco = volumen mayor).

Linea de enrase - el ojo debe estar al mismo nivel que la superficie de liquido.

Matraces aforados (para contener liquidos - no verter):

- forma de pera con fondo plano o ligeramente convexo y cuello largo, estrecho.

- el extremo cerrado por tapon hermetico de vidrio esmerilado o caucho o plastico.

- lleva marcada una linea delgada (de aforo) que indica la capacidad.

- en las paredes, se indica la capacidad y a que temperatura deben utilizarse.

- algunos estan calibrados para verter con 2 aforos o escala graduada en el cuello

- volumen: 0,025 lt - 1 lt

- se usan principalmente para la preparacion de disoluciones valoradas (concentracion conocida) y diluir muestras hasta un volumen fijo

1.preparar una disolucion a partir de un producto solido: se pesa el producto, se traslada a un vaso de precipitado, se disuelve con pequeño vol de disolvente, se trasvasa al matras aforado con embudo, lavando varias veces el vaso con el disolvente, se llena el matraz con el disolvente hasta la linea de aforo, se homogeneiza por rotacion y se añade disolvente gota a gota hasta la linea de enrase.

2.preparar una disolucion a partir de un liquido: se mide el volumen con una pipeta o probeta, se deja caer resbalando por la pared dentro del matras aforado, se añade el disolvente de la misma forma explicada anteriormente.

Pipetas manuales  (para transferir: 1 ml - 50 ml):

- capacidad 1,2,3,4,5,10,25,50 mililitros.

- llevan grabadas la capacidad y la temperatura a la que deben utilizarse en sus paredes

- llevan banda de color oscuro como codigo del volumen, presicion, tiempo de espera etc.

1.pipetas manuales (volumetricas) - medir un solo volumen de liquido (indicada su capacidad y la temperatura de uso)

2.pipetas graduadas - medir un volumen cualquiera hasta su capacidad maxima.

Manejo - succionar suavemente, aspirando despacio, cerrar el extremo superior con el dedo indice,  separar la pipeta del liquido y colocar la linea de enrase a la misma altura de los ojos, disminuyendo ligeramente la presion del dedo para dejar pasar el liquido hasta que la parte inferior del menisco coincida con el enrase.

- nunca deben pipetearse directamente con la boca liquidos corrosivos o venenosos (los acidos concentrados).

- nunca deben soplarse para eliminar las ultimas porciones de liquido.

- se puede utilizar aspiradores que se incorporan a la parte superior.

Micropipetas (pipetas lambdas) - para transferir cantidades muy pequeñas de liquidos (1 - 500 microlitros/ lambdas); Lang-Levy - muy exactas, pero muy poco utilizadas por su fragilidad y dificultades de limpieza.

Micropipetas automaticas (Eppendorf) - mayor precision, disminuye a fatiga de repetidas tareas, ventajosas en inmunoanalisis; funcionan mediante un piston, llevan puntas desechables de plastico (evitar contaminaciones), en volumen fijo o variable; algunas con dispositivo para la expulsion de la punta de plastico; para sustancias que reaccionan con el plastico ==> micropipetas con capilares de vidrio.

Probetas (menos exactos / poca precision) - con un pico en la parte superior para facilitar el vertido del liquido o con un tapon para contener.

Dispensadores automaticos - para agregar repetidamente un determinado volumen de un reactivo o diluyente a una solucion.

Utensilios Basicos de Laboratorio

1- Vasos de precipitado (no son exactos / no calibrados) - para verter facilmente los liquidos; para la preparacion de reacivos y como contenedores de sustancias.

2- Matraces Erlenmeyer (no son exactos) - vasijas de fondo plano y cuello corto; condensa vapores o retarda la evaporacion; contener las disoluciones a valorar.

3- Embudos - los que hay para filtrar, para transferir liquidos o solidos y de separacion con llave en el extremo inferior.

4- Tubos de ensayo y tubos de centrifga - redondo, conico en punta, conico.

5- Frascos lavadores - capacidad de 500 a 1000 mililitros.

6- Varillas de vidrio y puente de tincion

7- Gradillas

8- Escobillas y escobones

9- Triangulos

Material especifico del laboratorio clinico

1- Porta objetos

2- Cubreobjetos (cubres) - 18x18, 22x22, 22x32 mm

3- Placas de Petri

4- Cubetas

5- Recipiente de muestras

6- Pipetas Pasteur y pipetas cuentagotas

7- Asas de siembra

Camaras de Recuento - constituida por una placa base de vidrio especial de tamanyo semejante a portaobjetos; la parte central es separada de los extremos por unas ranuras, esmerilada y pulida donde se encuentra las cuadriculas de recuento; si un portaobjetos se coloca encima del campo central existe una ranura de 0,1 mm.

Neubauer improved - sistema de camaras de recuento mas utilizado en la actualidad; la profundidad de la camara es de 0,1 mm; la cuadricula de recuento muestra consiste en 9 cuadrados grandes, cada uno de 1 mm2.

Limpieza del material de laboratorio

Tipos de limpieza:

1- Limpieza a mano por frotado: por arrastre mecanico de la suciedad con un cepillo (si es necesario), agua del grifo, jabon y lejia, se enjuaga bien con mas agua y al final se enjuaga con agua destilada de un frasco lavador. El utensilio que no sea de plastico, seca en la estufa durante 30 minutos.

2- Limpieza a mano por inmersion: se colocan los aparatos en la solucion de limpieza, totalmente cubiertos durante 20-30 minutos, se enjuaga con agua corriente y al final con agua destilada.

3- Limpieza a maquina: maquinas lavadoras

Metodos de purificacion del agua

1- Destilacion (se obtiene agua de tipo I o II): el agua se calieta hasta la evaporacion, condensandose a continuacion; se obtiene agua exenta de sustancias extrañas y con muy baja conductibilidad (aparato - destiladores en acero inoxidale o de vidrio); se puede obtener agua bidestilada mediante un agente oxidante (permanganato potasico) que destruye materias organicas subsistidos despues del primer proceso. Inconvenientes: no elimina impurezas como el amoniaco, dioxido de carbono, cloro y algunos compuestos organicos; acumulacion en el destilador de las materias no volatiles que necesitara una limpieza periodica del mismo.

2- Desionizacion (se obtiene agua de tipo 2 o 3): purifica el agua que pasa a traves de una columna portadora de lechos de resinas de intercambio ionico acidas o basicas o una mezcla de ellas; las resinas son capaces de eliminar las impurezas cargadas positivamente o negativamente; la vida de la columna es limitada y puede ser regenerada con tratamiento alcalis o acidos (es necesario el control del agua obtenida). Inconvenientes: no elimina componentes organicos ni microorganismos; conveniente realizar una purificacion preliminar. Para obtener agua de tipo I, es necesaria un tratamiento posterior con carbon activado o filtros para eliminar microorganismos y impurezas organicas.

3- Osmosis inversa (se obtiene agua del tipo III): el paso bajo presion del agua a purificar a traves de membrana semipermeable que detiene particulas inorganicas y organicas (eficacia 90 - 100); es utilizado como sistema preliminar de purificacion del agua antes de pasar por una unidad desionizadora.

4- Filtracion (se obtiene agua del tipo III): el paso de agua a traves de membranas semipermeables; la calidad de la filtracion sera inversamente proporcional al tamaño del poro del filtro.

5- Adsorcion: se utiliza como agentes adsorbentes el carbon vegetal activado, arcillas, silicatos; mediante el paso del agua a traves de estas sustancias se logra principalmente la remocion de impurezas organicas.

APARATA JE DEL LABORATORIO

A. Baño Maria - recipiente con agua i el control de temperatura a traves del termometro (entre temp ambiente y 100ºC) que se puede ajustar con resistencia que calienta el agua (lo normal 37ºC). Se utiliza para incubar sueros, reactivos etc.

B. Centrifuga - acelera la sedimentacion natural de una disolucion; consta de un rotor donde se coloca las muestras. Tipos de cabezal:

- cabezal horizontal u oscilante: oscilan libremente entre las ramas del motor; las muestras dentro de los contenedores ocilan hasta poner en posicion horizontal, agulo recto con el eje del rotacion.

- cabezal angular de angulo fijo: los tubos de muestra estan en posicion fijo formando un angulo entre 25-40º con el eje de rotacion o tambien puede ser en angulo de 90º en caso de hematocrito.

El eje de la centrifuga - soporta el rotor y actua como el eje de la rotacion

El rotor

Los accesorios - temporizador, alarma, la luz.

Utilidad:

- separar suero /plasma de una sangre total, centrifugar 3000 rpm, 10-15 minutos

- concentrar celulas 10.000-15.000, 10-15 minutos

- sedimentos de liquidos biologicos (orina, liquido sinovial, etc.)

Manejo: tubos resistentes a la centrifugacion; tapas cerradas; equilibrar correctamente la centrifuga; tacometro - chequear la velocidad de la centrifuga; limpieza periodica de la centrifuga.

C. Autoclave (una olla de presion) - produce esterilizacion (capacidad de destruir todos los microorganismos incluyendo formas esporadas /esporuladas en virus de la hepatitis B que son capaces de sobrevivir a > de 100ºC) por calor humedo a presion; esterilizacion ==> metodo fisico y quimico (controles con tiras de papel).

Descripcion - camara esterilizadora con tapa hermetica; fuente de calor con resistencia electrica; un deposito de agua coneccion directa a la parte inferior del autoclave; sistema de purga de aire para evacuar el aire del interior de la camara esteril; valvula de seguridad que se descarga cuando sobre pasa y manometro y termometro para regular la presion y la temperatura.

Utilidad - esterilizar ropa, gomas, metales, liquidos; en general la presion es atmosfera y temperatura 120ºC, tiempo 15 minutos.

D. Estufas y Hornos - mantener en el interior una determinada temperatura a lo largo de un tiempo; tipos - 1. estufas bacteriologicas o de cultivo; temperatura - ambiente hasta 60ºC; 2. estufas para desecacion y esterilizacion con temperatura 50-300ºC.

Consta - caja interior con pared metalica, doble aislamiento, una puerta frontal (doble en estuva de cultivo), fuente de calor electrica y circulador de aire; las estufas de bajas temperatura utilizadas en el lab para la incubacion de germenes y para la incubacion de tecnicas inmunologicas; las que son de mas temperaturas ==> secado de material y esterilizar.

E.Basculas y Balanzas - masa y peso son intimamente unidos y confunden tomarlos como sinonimos; hay que diferenciar claramente.

Masa -  mide la cantidad de materia de un objeto y es invariable

Peso -  valor de la fuerza con que un objeto es atraido hacia el centro de la tierra, debido a que la atraccion de la gravedad varia con la altitud y latitud geografica; el peso es una unidad variable.

Condiciones que debe cumplir una Balanza:

- balanza exacta: cuando al añadir masas identicas a cada uno de los platillos no se modifica la posicion del equilibrio.

- balanza electronica exacta: en el display aparece un 0 sin intermitente.

Fidelidad/ precision - caracteristicas mas importantes de la balanza; si se repite varias veces una misma pesada, se obtiene el mismo resultado.

Sensibilidad - define la calidad de la balanza; la masa mas pequeña que es capaz de modificar el 0 de reposo de una balanza electronica.

Capacidad de carga - maxima carga que es capaz de pesar una balanza

Clasificacion segun su construccion - 1. mecanicas 2. electronicas

Clasificacion segun su sensibilidad - 1. de precision 2. analiticas

Balanzas de precision - su sensibilidad comprendidas entre 0,1gr - 0,01gr ( 100 mgr - 10mgr)

Balancas de analitica - su sensibilidad igual o menos de 0,001 gr (1 mgr)

DISOLUCIONES Y DILUCIONES

Disoluciones - mezclas intimas de dos o mas cuerpos diferentes que nos ofrecen a simple vista un aspecto homogeneo; cuerpo disperso o soluto (menor proporcion) y cuerpo dispersante o disolvente (mayor cantidad); disolucion en agua => disolucion acuosa; estado fisico de disolvente o soluto puede ser solido, liquido o gaseoso; la disolucion adopta el estado fisico del disolvente.

Disolucion saturada - cuando se alcanza el limite cantidad (maxima) de soluto que se puede disolver en un disolvente a determinada temperatura; disoluciones diluidas - baja cantidad de soluto; disoluciones concentradas - cerca de la saturacion.

Porcentaje en volumen (%v) - expresa los mililitros de soluto contenidos en 100ml de disolucion; % v = ml de soluto / ml de disolucion x 100

Porcentaje en peso - volumen (% p/v) - expresa los gramos de soluto contenidos en 100ml de disolucion; % p/v = g de soluto / ml de disolucion x 100

Diluciones -  aumentar la cantidad de disolvente de una disolucion ==> dos soluciones con distintas concentraciones, pero que contienen la misma cantidad de soluto; e.j. diluir muestras o reactivos para obtener concentraciones adecuadas a las tecnicas; la perfecta preparacion de estas diluciones es imprescindible para obtener resultados correctos.  Si diluimos una solucion, el volumen de la misma aumentara a la par que disminuye su concentracion, mientras que la cantidad de soluto presente permanecera constante; 2 soluciones con distintas concentraciones, pero que contienen las mismas cantidades de soluto, estan relacionadas de la siguiente forma;

V1 x C1 = V2 x C2; unidad C ==> gr / lt; V ==> ml

C2 = V1xC1 / V2 = C1 x V1/V2

El cociente de volumenes se domina cociente de dilucion y se representa 1/d:

C2 = C1 x 1/d

Para calcular la concentracion de la nueva solucion diluida, hay que multiplicar la concentracion inicial por el cociente de dilucion. Tendremos que dividir la concentracion inicial entre factor de dilucion.

En Inmunologia es frecuente la utilizacion de diluciones seriadas (despues de la primera son todas iguales). La razon de dilucion entre ellas es de ½ sin modificarse el volumen de los tubos.

Ejercicios:

1. Preparar 1 lt de etanol al 5% (v/v) ==> 50 ml de etanol  + 950 ml de agua ==> hasta completar 1 lt

2. Preparar 500 ml de etanol al 40% (p/v) a partir de etanol del 70% (p/v) ==> hay que averiguar el vol de solucion inicial que ha de coger ==> V2 = 40 x 500 /70 = 285,7 ml + agua ==> hasta completar 500 ml

3. Preparar 250 gr de solucion NaOH al 10% partiendo de un reactivo al 80% de pureza ==> hay que averiguar el peso de soluto NaOH de concentracion inicial 80% que ha de coger ==> 250 x 10 /80 = 31,25 gr + agua ==> hasta completar 250 gr de solucion liquida.

COMPOSICIÓN Y CARACTERISTICAS DE LA SANGRE (FISIOLOGIA SANGUINEA)

La sangre - un liquido, espeso, viscoso y rojo, esta compuesta por una suspension de celulas en un medio acuoso, impulsada a traves de los vasos sanguineos por la accion motora del corazon.

Volemia - 70 ml/kg de peso corporal (80% del peso corporal??) ==> 70 kg = 5 lt de sangre.

Viscosidad - la resistencia que ofrece un fluido a deformarse (la sangre es 5 veces la del agua) y depende del hematocrito y la concentracion proteica del plasma.

Temperatura = 37 oC; Ph  = entre 7,3 - 7,4; Nacl = igual que el agua del mar (3,5%)

Composicion:

1. Fraccion forme - 45% del volumen total (hematocrito) compuesta por eritrocitos, leucocitos y plaquetas.

Hematies - biconcavas, anucleadas, contiene proteina compleja Hemoglobina que da color rojo a la sangre y transporta O2/CO2, 4,5 millones /mm3, vida media de 120 dias y se producen en MO.

Leucocitos - redondadas y nucleadas, granulocitos (PMN neutrofilos, PMN eosinofilos y PMN basofilos), agranulocitos (linfocitos, monocitos), 5.000 - 10.000 /mm3, producidos en MO (linfocitos se desarollan en el timo, funcion de defensa).

Plaquetas - fracciones citoplasmaticas celulares de los megacariocitos (no son celulas completas), producidos en MO, intervenir en la coagulacion, 150.000 - 400.000 /mm3, vida media de 10 dias.

2. Fraccion liquida - 55% de total, transparente y ambarino, 90% agua; regulacion de la temperatura corporal; 10% ==> glucidos - glucosa (funcion energetica), lipidos - TG, colesterol, etc (funcion energetica y reserva); proteinas - albumina: reserva proteica, 55% de total porteinas plasmaticas, transporte de sustancias, concentracion 3 - 4,5 gr/dl, - globulinas - funcion inmunologica y transporte, fraccion muy heterogenea; se clasifican por electroforesis en alfaglobulinas, betaglobulinas y gammaglobulinas; 38% del total; fibrinogeno - 0,3% del total; funcion de la coagulacion sanguinea; cuando al plasma se le retira el fibrinogeno se le domina suero; funcion de proteinas plasmaticas: nutricion celular, transporte, mantener la presion osmotica; funcion inmunologica, coagulacion sanguinea; electrolitos (sodio, potasio, cloro, calcio); sustancias reguladoras (hormonas, enzimas, vitaminas); producto de deshecho (acido urico, urea, creatinina, bilirubina)

Funcion de la sangre:

1. transporte de O2 y CO2 mediante la hemoglobina, transporte de sustancias (sustancias absorbidas tras la digestion, medicamentos, secreciones hormonales, liquido intersticial)

2. defensiva de leucocitos (funcion fagocitica y produccion de anticuerpos que destruyen a microorganismos patogenos, protegiendonos de las infecciones)

3. Termoreguladora de la temperatura corporal (homeostasis).

4. Antihemorragica o hemostatica de las plaquetas y de los factores plasmaticos de la coagulacion, cuando se lesiona un vaso, la sangre detiene sus propias perdidas.

5. Funcion excretora que conduce productos de desecho de catabolismo hasta organos de excrecion (riñones).

El circuito de aparato circulatorio - Vasos sanguineos 96.550 km - desde el corazon la sangre pasa por las arterias (sangre arterial u oxigenada) ==> arteriolas ==> capilares (se produce intercambio gaseoso y nutritivo con las celulas) ==> venulas ==> venas ==> corazon.

ESPECTROFOTOMETRIA

La naturaleza de la radiacion electromagnetica

La radiacion electromagnetica -  una forma de energia radiante

Longitud de onda - la distancia entre dos max de un ciclo completo del movimiento ondulatorio (unidad nanometros 1nm = 10  -9 m = 1 mu = 10 A)

Frecuencia - numero de ciclos por segundo >< longitud de onda

Fotones - paquetes discontinuos de energia que depende de su freq y long de onda

Longitud de onda >< energia de radiacion electromagnetica

El espectro electromagnetico - cubre un intervalo de energia radiante desde rayos gamma (long de onda corta) hasta ondas de radio (long de onda larga); ojo humano puede captar 380 - 750 nm en color complementario; instrumentos puede captar onda mayores (IR) y menores (UV); luz solar o luz de filamento de tungsteno - mezcla de radiaciones de distinta longitud de onda (luz blanca).

La interaccion entre luz y materia (absorcion o emision energetica)

1. Proceso de absorcion - particula en estado de reposo o fundamental interacciona con un haz de luz ==> estado excitado ==> regresar espontaneamente al estado fundamental, desprender energia absorbida en forma de calor.

Espectro de absorcion - caracteristico de cada especie absorbente (cromogeno /solucion que absorbe la luz) representa la relacion entre la longitud de onda incidente y la absorbancia en condiciones definidas; utilidad - seleccionar la longitud de onda mas adecuada (absorcion maxima) para una medida cuantitativa y identificacion cualitativa.

2. Proceso de emision - compuestos que tras ser exitados, de retornar a su estado fundamental produce emision de energia radiante que se puede medir por tecnica fotometria o fluorescencia.

Espectrofotometria de absorcion - la medida de la radiacion que llega a un detector tras producirse absorcion de luz por parte de una sustancia absorbente. En analisis clinica el espectro: 220 - 800 nm.

Fotometro o colorimetro - emplea filtros

Espectrofotometro - emplea monocromadores prismas o redes de difraccion (ventajas: sensibilidad elevada, determinaciones rapidas y grado de especificidad alto)

LEYES DE ABSORCION

Transmitancia - la relacion entre la luz incidente y la luz transmitida (intensidad menor)

Solucion de referencia (blanco) - se tara para evitar interacciones por parte del solvente o cubeta, asi se mide solo la absorcion del compuesto de interes.

Absorbancia - no es una cantidad medible; se calcula a partir de la transmitancia (la concentracion >< y logaritma transmitancia; la concentracion =proporcional la absorbancia)

La ley de Beer - la absorbancia de una solucion es directamente proporcional a la concentracion y a la longitud del paso de luz; aplicacion: averiguar la concentracion de una sustancia de interest en una solucion, basandonos en la relacion lineal:

1. por comparacion con una solucion conocida: Ast/Ap = Cst/Cp o

Cp = Cst x Ap/Ast

2. curva de calibracion: ensayar varias soluciones de concentraciones conocidas en identicas condiciones y determinar sus absorbancias ==> se construye la curva de calibracion (recta) ==> averigua por interpolacion de las absorbancias de las soluciones problema en la recta de calibracion.

Cuando la concentracion de cromogeno en la solucion sobrepasa los limites de linearidad, la ley de Beer deja de cumplirse, conviertiendose la recta de la grafica en una curva a partir de ese punto de concentracion (indica:falsamente baja de cromogeno); ante esta situacion, hay que diluir la muestra para que su concentracion entre dentro de los limites de linearidad (diluir en ½, despues multiplicar en 2).

Instrumentacion de Fotometros y Espectrofotometros:

- fuente estable de energia radiante (lampara de filamento de tungsteno 360-950 nm)

- rendijas de entrada y salida (estrechan /reducir la luz difusa, evitar que se dispersa)

- selector de longitud de onda /monocromador (bandas espectrales mas estrechas y se ajustan facilmente dentro de una amplia zona del espectro)

- cubeta de plastico contiene la muestra (el proceso de absorc con 1 cm de paso de luz)

- detector de energia radiante (convierte la energia radiante de la luz no absorbida/transmitida en energia electrica)

- presentacion de datos (lector digital que registra la energia electrica)

Espectrofotometros de haz simple

Fuente de luz => rendija de entrada => monocromador => luz incidente => rendija de salida => cubeta => luz transmitida => detector => medidor/lector

ASPECTOS PRACTICOS

Empleo de blancos - elimina posibles interferencias de absorcion o reflexion por parte de la cubeta o solvente del cromogeno / reactivo; blanco de sueros - el suero diluido en la misma proporcion en un solvente inerte, con el que no reaccione para eliminar posibles hemolisis, lipemia, bilirrubinemia, color de una orina, etc.; blanco de reactivos - elimina posibles interferencias que pueda introducir el reactivo.

Desviaciones de la Ley de Beer - producidas en la linearidad de la relacion entre concentracion y absorbancias; la recta se curva antes de su limite de linearidad; causas:

- se miden concentraciones muy elevadas de cromogeno

- la radiacion incidente no es monocromatica (el aparato estropeado)

- la absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto

- la luz es transmitida por otros mecanismos (problema del aparado)

- los lados de la cubeta no son paralelos

- interferentes de otros cromogenos que absorben tambien esa long de onda

- si existe fenomeno de fluorescencia

Calibrador / Standar / Patron

Es un especimen / analito / solucion que conocemos la concentracion exacta del analito. Los terminos son sinonimos aunque el termino Standar o Patron se utiliza mas para referirse al preparado comercial donde el analito esta disuelto en H2O o buffer aquosa (ph conocido).

El termino Calibrador se utiliza mas al hablar del standar para autoanalizadores, donde el analito disuelto en suero, plasma o solucion de una viscosidad semejante.

Standar - pueden llevar 1 o mas analitos aunque normalmente solo lleva 1

Cpr      =          Apr      x          Cst      (formula viene de => Ast/Apr = Cst/Cpr)

                        Ast

E.j. Standar de colesterol 250 mgr / dl

Reactivo (R), Tubos 1/1, 1/2, 1/3, 1/4, buffer suero fisiologico, cubetas, espectofotometro.

1/1 ==>           50 micro litro St + 500 micro litro R

1/2 ==>           25 St + 500 R

                        50 St + 1000 R (no!)

                        50 (1/2 - diluida en SSF) St + 500 R

1/3 ==>           50/3 St + 500 R

                        50 St + 1500 R (no!)

                        50 (1/3 - diluida en SSF) + 500 R

1/4 ==>           50 (1/4 - diluida en SSF) + 500 R

Control (suero humano deshidratado)

Es un especimen conocido del intervalo de concentracion de uno o mas analitico.

St Glucosa      ==>     150 gr /dl

Control (que se usa)        ==> 135 - 155 gr /dl (no es exacta /aprox.)

Los controles y los standares se usan para calibracion y valoracion de las tecnicas y control de calidad de los aparatos de laboratorio. Se presenta en forma de liofilizacion para alargar el periodo de caducidad. Algunos son en forma liquido.  Es importante saber reconstituir St y Controles.

OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE

Introduccion

Sangre - liquido rojo y espeso que circula por sistema vascular sanguineo y formada por plasma + elementos solidos en suspension. Podemos diferenciarlas en 3 tipos segun por elemento vascular que circulan (arterial, venosa, capilar).

Para la extraccion de cada tipo de sangre, necesitamos el mismo material, pero el metodo varia sensiblemente. Como norma general evitaremos pinchar a ciegas para no martilizar al paciente. Debemos tener paciencia, habilidad y comprension.

Diferencias

No existe una diferencia signifacativa entre ellas. La sangre arterial tiene + O2 y se utilizara para la determinacion de gases y ph en sangre. La glucosa se encuentra en mayor proporcion en sangre capilar (10 - 30% mas).  Tampoco conviene determinar potasio en sangre capilar, debido que puede aumentar por la compression ejercida al hacer la extraccion.

Plasma y Suero

Suero - porcion liquida de la sangre que queda tras la centrifugacion de sangre coagulada. No tiene elementos formes ni fibrinogeno ni la mayoria de los factores de coagulacion.

Plasma - porcion liquida de sangre que queda tras la centrifugacion de sangre anticoagulada. No tiene elementos formes, pero si fibrinogeno y factores de coagulacion.

Obtencion de sangre capilar

Se puede obtener de lobulo de la oreja, de los pulpejos de los dedos anular y corgado y dedo gordo de pie o del talon (niños).

Material - algodon /gasas, alcohol, lanzetas con o sin lanzador, tubos de capilares heparinizados, guantes, rotulador /etiquetas y plastilina.

Procedimiento - elegir el area a puncionar, frotar vigorosamente con algodon + alcohol para reactivar la circulacion y secamos al aire. Mediante la lanzeta efectuar una puncion profunda. Desechamos la primera gota mediante algodon /gasas, efectuar una presion alternativa en la zona, 1 cm por encima del lugar de puncion para que salga la sangre.  Recoger la sangre mediante el capilar heparinizado presionando y aflojando sobre la zona hasta que tengamos suficiente sangre. Posteriormente aplicamos algodon + alcohol sobre el lugar de puncion presionando hasta que deje de fluir la sangre. Poner plastilina por un extremo del tubo. Identificamos la muestra.

Precauciones - no hay que ejercer demasiada presion, porque sino, ademas de la sangre, saldra tambien liquido tisular. Nunca pinchamos en miembro edematoso, infectado, o inflamado. Secar la primera gota de sangre que pueda quedar plaquetas adheridas y darnos falsas trombopenias y por otro que se nos coagule la sangre.

Obtencion de sangre venosa

Las venas deben de evaluarse y nunca pinchar a ciegas. Normalmente se escoge venas de flexura del codo (cefalica, basilica o mediana basilica). Si no podemos pinchar un brazo, intentaremos en el otro brazo. Sino, en las venas de las manos /pies.

Material - guantes, alcohol, algodon, goma compressor (smarch), jeringas, agujas, material extraccion de vacio (0.8 / 0.9 agujas o las palomitas), tubos de recogida  con o sin coagulante, etiquetas o rotulador de vidrio.

Procedimiento - preparar el material, colocar el paciente sentado / tumbado, brazo extendido y puño cerrado. Seleccionar la vena a pinchar, y la palpamos. Elegimos el volumen de jeringa, montamos la aguja sobre la jeringa, comprobamos que el embolo funciona bien. Colocarse los guantes y aplicar el smarch por encima de la vena que se va a puncionar.  El Smarch tiene que ser colocado sufficientemente fuerte, para el paso de sangre venosa, pero no tan fuerte como para impedir el flujo. Pedir al paciente que abra y cierre la mano alternativamente para favorecer la dilatacion de la vena. Palpar la vena con el dedo indice, desinfectar la zona con el algodon y alcohol / yodo y proceder a la extraccion, teniendo cuidado de colocar el bisel hacia arriba. La inclinacion de la aguja sera 45o, extraer cuidadosamente y cuando esta apunto diacabar, retirar el smarch, sacamos la aguja y presionar la zona de venopuncion con el brazo extendido. Retirar la aguja de la jeringa y distribuir la sangre en los tubos siempre resbalando la sangre por la pared del tubo. Los tubos que lleva anti coagulante, se agitar suavemente y etiquetar el tubo.

Sistema del vacio - en las casas comerciales vacutainer / venoject. Material es el mismo cambiando la jeringa y aguja con el sistema de vacutainer / venoject. El procedimiento - lo mismo.

Palomita - el material es el mismo cambiando con palomita.

Observacion - evitar la extraccion en un miembro donde se aplica solucion parenteral. Si no queda mas remedio, pinchar por encima de la via. Tampoco pinchar hematomas, o infecciones. Tener siempre bien preparados los tubos y etiquetarlos. No extraer sangre ni lenta ni muy rapido. Se extrae los tubos cuando ya no llena mas / dejar de llenar.

Obtencion de sangre arterial

Suponer cierta mayor dificultad que sangre venosa. Ademas riesgo de hemorragia, las punciones arteriales pueden provocar dolor, hematomas, lesiones nerviosas, alteracion de circulacion, espasmo arterial, trombosis etc.

Zonas adecuadas - arteria radial, humeral y femoral. Arteria radial es la mejor eleccion por razones:- relativamente superficial. Si hay problema, la arteria cubital proporcionaria una circulacion colateral a la mano.

Antes de realizar puncion arterial, tener en cuenta factores que nos podrian falsear los resultados de analisis (hiperventilacion) que provoca el temor del paciente al ser pinchado. Pueden falsear los niveles de PCO2:

- exceso de heparina en la jeringguilla altera niveles de PH y PCO2 en sangre.

- aire ambiental mezclado con la muestra

- metabolismo de celulas sanguineas, altera el resultado (+/- tiempo)

Material - jeringuilla 2 ml, agujas de bisel corto, heparina, alcohol, povidona yodada (betadine), torundas / gasas, etiquetas, guantes, o un kit de jeringa.

Procedimiento - Explicar al paciente que se le va hacer y procurar que no este ansioso. Las manos lavadas y guantes puestos. Aspirar la heparina necesaria, cubrir toda la jeringa y expulsar de vuelto y solo nos que da heparina en el espacio muerto. Elegir punto de puncion (normalmente arteria radial de la mano no dominante). No pinchar en zona hematomas, heridas y infeccion. Colocar el brazo del paciente con muneca extendida y en rotacion. Comprobar la circulacion lateral utilizando la maniobra de Allen. Mientras el paciente abre y cierra el puno comprimir ambos arterias (radial y cubital) hasta que la palma este palido, se deja de presionar la arteria cubital. Mientras se continua presionando arteria radial, a continuacion la palma deja de estar palido por el flujo que entra de la arteria cubital. Si no es asi, no deberiamos pinchar esta mano.

Preparar zona a puncionar con alcohol / povidona (yodo). Colocar otros guantes. Localizar arteria radial colocando indice y corazon en los estremos de la parte que notamos el latido. Sujetamos el embolo como lapiz y pinchar con bisel hacia arriba, penetrar lentamente la piel en un angulo de 45o directamente encima del punto max. del pulso. Avanzar con aguja y parar cuando veamos el retorno del flujo sanguineo. Tirar el embolo hacia atras para extraer. Extraer la aguja de la jeringa y taponar presionando la zona de puncion (al menos 15 minutos)

ANTI COAGULANTE

Concepto

Anticoagulante - sustancia que se oponen / retarda la coagulacion de sangre, circunstancia que ocurre de forma natural cuando se extrae del torrente circulacion.

Clasificacion

Atendiendo su naturaleza y mecanismo de accion:

1- Inhibidores naturales: anticoagulantes que circulan /producido por el propio organismo (heparina  + AT III)

2-Anticoagulacion de accion en vivo: productos medicamentosos que pueden tener accion directa sobre la sangre (heparina, dicumarinicos - accion anti vit K).  Estos medicamentos se utilizan cuando existe una hiper coagulabilidad.

3-Anticoagulacion de accion en vitro: la accion se produce fuera del organismo (usados en los labs; e.j. EDTA).

Tipos de anticoagulante en vitro

Los anticoagulante deben de elegirse en funcion de las determinaciones que se vayan a realizar, asegurándose que su presencia no afectara a los resultados. Los anticoagulante puede utilizarse en forma liquida o secarse en las paredes de los tubos de recogida. Los mas utilizados:

1- Oxalato (de Li/litio, K/potasio o Na/sodio)

Su mecanismo de accion - inhibir la coagulacion al combinarse con el calcio sanguineo Ca++ factor IV de la coagulacion y precipitarlo.

Desventaja - disminuye hematocrito, porque contraer los hematies y si seutilizan en alta dosis pueden provocar hemolisis.

2- Citrato (de Na) en forma liquida.

Para determinar VSG y pruebas de coagulacion en estos casos: citrato trisodico al 3,8%. Tambien en banco de sangre para anticoagular sangre destinada a las transfusiones. Para las pruebas de hemostasia, seutiliza en proporcion 1+9 y para VSG 1+4.

Mecanismo de accion - lo mismo al oxalato

3- Solucion de ACD (acido citrico citrato destrosa).

No se utiliza en lab, pero si en hemoterapia /banco de sangre para conservar sangre gracias a su PH.

Mecanismo de accion - lo mismo

4- Fluoruros

Se usa muy poco, tiene doble accion de mecanismo - Quelan el Ca++, miden la glucolisis de los hematies. Se utilizaba (antes) para medir la glucosa.

5- EDTA (epsilon diamino tetra acetico)

Pueden utilizarse la sal disodico Na2 EDTA o tripotasica K3 EDTA - mas usada.

Mecanismo de accion - lo mismo

Deben respetarse la proporsion de anticoagulante - sangre. Un exceso de EDTA nos va a modificar la morfologia leucositaria y eritrocitaria. Es mas utilizado en hematologia. Nos permite conservar la sangre 24 horas a 4º C sin modificacion.

6- Heparina

La que menos interfiere en las diferentes pruebas, pero no para hacer frotis sanguineos, porque al teñirlos, imprime coloracion muy azulada al fondo.

Mecanismo de accion - inhibir dentro de la cascada de coagulacion, el paso de protrombina (II) a trombina (IIa) ==> Fibrinogeno (I) a Fibrina (Ia).  Estabilizador de las plaquetas: la mas usada es heparina de litio a razon 20 por ml de sangre.

En todos los casos debe hacerse al menos 60 inversiones del tubo (2 minutos en el agitador hematologia).

Conservacion

Cuando una sangre entera se conserva > 24H, los parametros tanto bioquimicos como celulares se alteran, sobretodo los leucositos; por ello para poder conservar sus componentes bioquimicos > 24H es imprecindible la centrifugacion de esta sangre 3000 rpm 15 minutos y su posterior separacion de su suero / plasma y ademas conservar la a 4ºC o mejor su congelacion.

EL MICROSCOPIO

Microscopio – instrumento que permite amplificar la imagen de un objeto o de un ser pequeño (micros: pequeño y scopein: ver); inventado 1610 por Galileo, el primer científico italiano observando el exterior de una abeja o Jansen, el holandés. 

Fundamento – Si se sitúa entre el ojo y el objeto un sistema óptico capaz de aumentar el angulo visual, se podrá ver el objeto con mayor amplitud y claridad. El sistema de lentes - produce una imagen aumentada de una muestra diminuta. El objetivo - pequeña lente de proyección que aumenta y proyecta la imagen primaria del objeto hacia el extremo superior del tubo del microscopio (imagen aérea). El ocular (lupa) - aumentando la imagen aérea. La imagen final - se forma en la retina del ojo. La imagen virtual (el ojo percibe la imagen final en el plano virtual).

Aumento – es el numero de veces que se ve el tamaño de un objeto por encima de su valor real. En el microscopio óptico compuesto, se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo por el aumento individual del ocular. Objetivo - x4, x10, x40, x100.  Aumento óptico ocular - x5, x10

Resolución – la capacidad del microscopio para mostrar los detalles más finos de un objeto. Poder de resolución (limite de resolución o distancia resoluble) – la distancia minima entre dos puntos que permite distinguirlos como tales (la capacidad de microscopio para distinguir 2 puntos separados aunque están muy próximos entre si.

Disminuir la distancia resoluble = aumentar el poder de resolución = aumentar la apertura numérica (AN) = disminuir la longitud de onda de la luz empleada = aumentar el ángulo alpha en el espacio objeto = aumentar el índice de refracción (IR) en el espacio objeto (rellenar el espacio existente entre la muestra y el objetivo con una sustancia de mayor índice de refracción, como aceite).

Numero de campo – diámetro de la imagen observada a través del ocular (en mm).

Profundidad de foco – el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por completo >< aumento y AN de la lente.

El contraste – para mejorarlo, disminuye el cono de iluminación (se controla mediante el diafragma de apertura) procedente del condensador.

Partes de un microscopio óptico compuesto:

Parte mecánica – sistema de soporte o estático (pie, brazo, cabezal); sistema de ajuste (anillo de ajuste de las dioptrías, tornillo de fijación del cabezal, tornillos reguladores de la platina, tornillo de elevación del condensador, tornillos de centrado del condensador, tornillo de seguridad del condensador, control del diafragma de apertura del condensador, anillos de enfoque macrométrico y micrométrico, control de ajuste de la claridad/ la luz).

Parte óptica – sistema de iluminación (fuente de luz - lampara halogena de intensidad graduable; condensador - dispositivo que contiene una lente que concentra la luz, generada en la lampara, hacia la preparación; diafragma de apertura - el control adecuado del cono de iluminación que atraviesa la muestra y entra en el objetivo = se ajusta AN); lentes (objetivos - generan imagen real, invertida y aumentada del objeto; oculares - captan la imagen formada por el objetivo y la amplian)

Material necesario para la visualización microscópica – portaobjetos esmerilado y biselado, cubreobjetos 22x22, líquido de inmersión (se usa sin cubreobjetos) es imprescindible cuando se observa muestra desecada con objetivo de 100x  (tradicionalmente aceite de madera de cedro, actualmente aceites sintético)

Tipos de microscopios:

Microscopio de campo oscuro – si dentro de la muestra hay elementos transparentes, con un indice de refracción diferente al del medio que los circunda, la luz es difractada e incide sobre el objetivo y pueden ser visualizados; permite la observación de seres microscópicos transparentes y no teñidos (treponema pallidum – preparación en fresco).

Microscopio de fluorescencia – consta de una fuente de luz muy intensa (lámpara de Hg a alta presión), emite una radiación que puede incidir en la muestra desde abajo, tras atravesar un condensador de campo oscuro (iluminación transmitida); se emplea un tipo especial de liquido de inmersión (glicerina); Tipos de fluorescencia:  Fluorescencia primaria - fluorescencia natural (auto fluorescencia) - vitamina A-tiamina, vitamina B-riboflavina; Fluorescencia secundaria - colorantes fluorescentes: auramina (demostrar la presencia del bacilo de Koch en esputos), naranja de acridina (detectar gardnerella vaginalis en los exudados vaginales; Fluorescencia terciaria inmunofluorescencia - fijación del fluorocromo (colorante) como rodamina y ficoeritrina al elemento investigado (a traves de Ac marcado).

Fuente de luz => Filtro primario => Muestra Fluorescente => Filtro secundario => Luz fluorescente

                           de exitacion (UV)                                                                          Observador

Microscopios electrónicos de transmisión (TEM) – una gran amplificación y permite la observación de elementos que son demasiado pequeños como para ser vistos en un microscopio óptico, pero no sirve para observar elementos vivos, a causa del vacío que ha de establecerse dentro del tubo y es muy costoso (solo se usa en lab de investigacion). El poder de resolucion en microscopio electronico es x1000 > que microscopio optico; emplean electrones en lugar de unas fotones; microscopio optico < 200 nm - fotones: 400 - 700 nm longitud de onda.

Microscopio electrónico de barrido (MEB) – no tiene tanto poder de resolución como el de transmisión, pero sin embargo, proporciona una enorme profundidad de campo y genera unas imágenes que producen una gran sensación de tri dimensionalidad. 1973 se comercializo el 3º modelo que une las caracteristicas de los 2 anteriores (la gran resolucion de los TEM y la gran definicion y contraste de los MEB.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA SANGRE mira apuntes!

Volemia (volumen de sangre circulante) 68 – 77 ml por kg de peso corporal (70 kg = 5 lt de sangre).

Valor hematocrito (fracción forme) 45% del volumen total.

Trombocitos (plaquetas) – fragmentos de células megacariocitos, ovalada, sin núcleo, células mas pequeñas, factores de coagulación en su interior, 140.000 – 400.000 por mm3, se producen en MO y destruidas por los macrófagos del sistema retículo endotelial (SRE) situado en la medula ósea en el hígado y en el bazo, dura unos 10 días.

Eritrocitos (hematíes/ glóbulos rojos) – disco bicóncavo, sin núcleo, proteína compleja en su interior (hierro, hemoglobina), 4.500.000 por mm3, las mas abundante, se producen en la medula ósea, dura 120 días, destruidos por los macrófagos del SRE (Hb se transforma en bilirrubina – color amarillento y eliminada por hígado a través de la bilis)

Leucocitos (glóbulos bancos) – células mas grandes, las únicas con núcleo, granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos), agranulocitos (monocitos y linfocitos) 5.000 - 11.000 por mm; formula leucocitaria (porcentaje que representa el numero de leucocitos de cada tipo con respecto al numero total de ellos), granulocitos y monocitos se forman en la medula ósea exclusivamente, a los linfocitos intervienen los ganglios linfáticos y órganos linfoides, destruidos por los macrófagos del SRE.

Plasma (fracción liquida) – 55% del volumen total, transparente de color ambarino, constituido 90% por agua, 10% sólidas (glucidos: glucosa, lipidos: colesterol triglicéridos, proteínas: albúmina, globulinas, fibrinógeno, etc., electrolitos: iones sodio, potasio, calcio, cloruro etc., sustancias reguladoras: vitaminas, enzimas, hormonas, productos de desecho: acido úrico, urea, creatinina, bilirrubina, etc.) se llama suero cuando se le retira el fibrinógeno.

Funciones de la sangre – respiratoria, nutritiva, regulación hormonal, excretora, regulación térmica, mantenimiento del volumen intersticial, mantenimiento de pH (ph. plasmático es 7,4), defensiva, hemostática (plaquetas y sustancias factores de coagulación).

Características físico químicas de la sangre:

Viscosidad – la resistencia que ofrece un fluido a deformarse (+hematocrito => policitemia vera, +fibrinógeno plasmática => hiperfibrinogenemias, +globulina => mieloma múltiple), síndrome de hiperviscosidad (aumento de la viscosidad).

Osmolalidad plasmática – el numero de partículas de soluto presentes en una masa de disolvente, osmolalidad plasmática normal 280 – 300 mOsmol/kg de agua, depende de la concentración en iones sodio (Na+) su soluto mas abundante, regulada por hormona antidiurética/ADH (generada en la nurohiposifis), osmolalidad (+) diabetes insípida por déficit de ADH, coma hiperosmolar de la diabetes mellitus.

El sistema retículo endotelial (SRE) o mononuclear fagocítico – tejido presente en el bazo, hígado y medula ósea, comprende a los capilares sinusoides (senos venosos) de estos órganos formados de dentro a fuera por dos capas: una capa de células reticulares (macrófagos bordeantes o células reticulares bordeantes) con poros entre ellas que pueden ser atravesados por otras células (hematíes que están en buen estado); cuando realizan su actividad macrofagica, su volumen aumenta, su citoplasma se llena del material fagocitado y su núcleo se vuelve voluminoso, ovalar y con un nucleolo bien visible (células de Kupffer); una capa de fibras de reticulina (una red que rodea circularmente a las células bordeantes y las separa de las otras células del órgano.

EXTENSIONES SANGUINEAS

Extensión o frotis sanguíneo – recubrir parcialmente un portaobjeto con una gota de sangre, de tal manera que las células de esta se dispongan formando una sola capa de  ellas; se puede hacer manual o automáticamente con un Skinner que centrifuga el porta con la sangre depositada en su centro. Partes: cabeza (donde se encuentra mayor proporción de linfocitos y los hematíes forman pilas de moneda), cuerpo (adecuada proporción entre los distintos tipos de leucocitos), cola (se encuentra mayor proporción de leucocitos grandes (granulocitos y monocitos, los hematíes deformados y plaquetas), bordes (contienen una mayor proporción de leucocitos grandes, difíciles de reconocer si están deshilachados/deformados).

Una buena extensión – fina y homogénea con barbas, longitud de ¾ partes del portaobjetos.

Defectos de una extensión – excesiva o escasa longitud y grosor (inadecuado tamaño de la gota de sangre), escalones o estrías (falta de uniformidad en el deslizamiento), zonas redondeadas (presencia de restos de grasa o de suciedad en el porta), excesivamente dentado/desflecado.

Utilidad – análisis morfológico de las células hematicas, realización del recuento diferencial linfocitario (RDL) y reticulocito, la distinción de una autentica trombopenia de una pseudotrombopenia producida por agregados plaquetarios y comprobar el funcionamiento de los autoanalizadores hematológicos.

Practica VII (realización de una extensión sanguínea):

Material: 2 portas limpios, guantes desechables, rotulador de vidrio

Reactivo: desinfectante alcohol etílico (etanol) 70º o povidona yodada, solución de etanol-éter etílico en proporción de 50:50

Muestra: Sangre capilar no anticoagulada o sangre venosa adecuadamente anticoagulada con EDTA (no con heparina para no producir un fondo azul con el colorante de Wright) extraída en menos de 3 horas para no alterar su morfología. Sangre capilar contiene más hematíes y leucocitos y menos plaquetas que la sangre venosa.

Técnica – depositar una gota de sangre (5 ul) a 2 cm de un extremo de la porta; formar un ángulo de 45º con el porta esmerilado, dejar que la gota se extienda por capilaridad a lo largo del extremo del extensor; deslizar la porta hacia otro extremo, secar al aire y escribir el nombre del enfermo.

TINCIONES HEMATOLOGICAS

Coloración de las estructuras que componen las células sanguíneas:

Tinciones vitales – se practican sobre células que están vivas (introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo, p.e. el verde Jano, el azul de metileno

Tinciones supra vitales – se practica sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo de que proceden.

Tinciones no vitales – se realizan sobre células muertas.

Fijación – conservar inalteradamente la estructura y adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos (mediante calor o etanol o metanol)

Tinciones tradicionales – derivados de anilina (4 grupos): colorantes ácidos (eosina) para estructuras alcalinas como hemoglobina; colorantes básicos (azul de metileno) para las estructuras acidas como ácidos nucleicos; colorantes neutros (eosinato de azul de metileno) tiñen núcleo de un color y el citoplasma de otro; colorantes indiferentes, insolubles en el agua (Sudan III - para teñir las grasas) tiñen sustancias con poder de disolución superior al del liquido empleado;

Colorantes Romanowsky consta de colorante acido (eosina) y colorantes básicos (tiaminas – azul de metileno y sus derivados) obtenidos por desmetilacion oxidativa (azur); se emplean en el diagnostico hematológico son la de Wright y la Giemsa sola o en combinación con la de May Grunwald.

Las tinciones especiales – se usan en circunstancias específicas:

-Tinción fluorescente: colorantes (fluoro cromos) se fijan a las células y estimulados por una luz ultravioleta, emiten un color característico; los más utilizados: naranja de acridina y el rojo neutro.

-Tinciones histoquímicas: tenyir la presencia o la ausencia de sustancias localizadas en el interior de los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos; sirven para reconocer células leucocitaria normales o anómalas (diferenciar unas clases de leucemias de otras).

Las estructuras coloreadas:

-Estructuras acidofilas u oxifilas: fijan naturaleza acida, captan la eosina/ atrae estructuras basicas (eosinofilas); tincion tradicionales - adquieren un color rosado.

-Estructuras basofilas: fijan naturaleza alcalina (tinción tradicionales - adquieren color azulado; tinción tipo azur-azurofilas-color lila o púrpura); atrae estructuras acidas

Errores en las tinciones tradicionales de frotis:

-Demasiado rosa: ph bajo, tiempo insuficiente, lavado excesivamente prolongado)

-Demasiado azul: un grosor excesivo de extensión, pH alto, tiempo excesivo, lavado insuficiente)

-Aparecen artefactos o/y precipitados en la extensión: portaobjetos sucios, falta de filtración, tiempo excesivo, secado del colorante, lavado insuficiente)

Practica IX (tinción de Giemsa): neutro?

Introduccion: Las tinciones hematologicas tipo Romanowsky: Giemsa, Wright, Leishman y panoptico de Pappenheim (May-Grunwald - Giemsa), y panoptico rapido - capaz de discriminar entre las distintas estructuras celulares. 

Tecnica:

-un frotis /extensión en puente de tinción

-cubrir /fijar el frotis con metanol durante 3 minutos, escurrimos y dejar secar al aire

-cubrir con GIEMSA de Panreac diluido 1/7 con solución tampón, recién preparada durante 25 minutos

-lavar con agua grifo y posteriormente con agua destilada

-dejar secar en vertical

-observar con objetivo de 100x con aceite de inmersión

-Los hematíes se tiñen de color rosa malva, las plaquetas de color violeta, los neutrófilos (núcleo de color azul violeta, citoplasma rosa y granulación finas de color violeta rojizo), los eosinófilos (citoplasma de color rosa con gránulos rojo anaranjado abundantes), los basófilos (núcleo de color púrpura, granulación de color azul oscuro) el citoplasma rosa no se ve /tapado, los monocitos y linfocitos (nucleo de color azul violeta, citoplasma azul, mas claro en el linfocitos que en el monocito - azul grizace)

Practica XI (tinción panóptico rápido):

Fundamento: tecnica de inmersion my rapida y sencilla de realizar.

Tecnica:

-una buena extensión /frotis sanguíneo

-sumerge en el 1ª solución (alcohólica de triarilmetano o metanol)  fijar 5 segundos mov. de vaiven

-sumergir en 2ª solución (tamponada de xanteño/acido) 3-5 segundos

-sumergir en 3ª solución (tamponada de tiazina/básico) 15 segundos

-escurrir entre paso y paso y secar la gotitas

-lavar el exceso con agua destilada/ de grifo (dejar caer suavemente), dejar secar

-observar al microscopio de 100 x con aceite de inmersión

Lectura:

-Los eosinofilos salen mas oscuros (maronazos)

-La diferencia de las otras tinciones: se permite reteñir y se puede variar la intensidad de tincion modificando el tiempo en los colorantes no.2 y no.3, segun desee destacar las tonalidades ros as o azules.

Tinción May–Grunwald – GIEMSA (con barilla/ puente de tincion):

-una buena extensión o frotis sanguínea

-cubrir el frotis con MG durante 2 minutos, 

-sin retirar el colorante, cubrir con el mismo volumen de agua destilada 2 minuto

-se retira el exceso sin lavar

-cubrir con GIEMSA 1/10 durante 20 minutos (dilucion: 2 gotas de Giemsa/ ml de agua destilada)

-lavado con agua destilada, dejar secar

-observar al microscopio de 100x con aceite de inmersión

Tincion May Grunwald - Giemsa (por inmersion):

-una buena extension o frotis sanguinea

-1er cubeta de colorante May-Grunwald durante 2 minutos (sumergida)

-2nd cubeta de colorante May-Grunwald 1/1 extemporanea (50% diluido en agua destilada o solucion tampo de PH neutro durante 3 minutos (sumergida)

-3er cubeta de colorante Giemsa duluido estemporaneamente 1:10 durante 20 minutos (sumergida)

-escurir entre cubetas

-lavar con agua del grifo, secar y observar 100x con aceite de inmersion.

RECUENTOS CELULARES

RECUENTOS DE CELULAS DE SANGRE

Camara Neubauer Mejorado

-Tiene superficie de 9 mm2 en 9 cuadros grandes. Cada cuadro grande tiene  de 1 mm2 de superficie y de 0,1 mm de altura. Por tanto tiene 0,1 mm3 de volumen.

-Cuadrado grande central se compone de 25 cuadros medianos de 0,2 mm de lados cada uno y 0,04 mm2 de superficie.

-Cada uno de cuadro mediana tiene 16 cuadros pequeños y cada uno tiene 0,05 mm de lado cada uno, es decir 0,0025 mm2 de superficie.

-Los cuadrados medianos estan limitado por un triple rallado, cuya linea media es la linea de separacion para delimitar que hematie se encuentran en un cuadrado y cuales no estan dentro.

CONTADOR AUTOMATICO

Recuentos de Leucocitos

- El canal peroxidasa (enzimas leucocitarias),

se recuentan los leucocitos y se realiza la formula leucocitaria a excepcion de los basofilos. En este canal, celulas rojas son lisadas conservando celulas blancas, que son fijadas y teñidas de manera especifica. La intensidad de la de la tincion es proporcional a la actividad peroxidasa.

- Eosinofilos produce intensa actividad peroxidasica

- Neutrofilos produce actividad peroxidasica fuerte

- Monocitos produce actividad peroxidasica debil

- Linfocitos y LUC no tienen actividades peroxidasicas

Por otra parte, celulas pasan de 1 a 1 a traves de detector de luz y detectan en campo oscuro, sensibles a la luz difractada (analisa el tamaño celular) y otro detectan en campo brillante, sensible al grado de tincion (mide la absorbancia), aqui donde se produce la diferenciacion por la actividad peroxidasica.

Las celulas vienen caracterizadas por una combinacion del tamaño y actividad peroxidasica.  En el citograma, la difraccion del tamaño celular en el eje Y y en el eje X (abscisas) actividad peroxidasica (absorbancia).

La formula de recuento diferencial se hace sobre 9.000 celulas. El sistema informatico incorporado, calcula, define y analisa las agrupaciones de celulas. En el canal de peroxidasa se hace el recuente de celulas blancas y formula de recuento diferencial a excepcion de los basofilos. Tambien en este canal, se realiza el parametro MPXI (indice medio de peroxidasa) que refleja la actividad peroxidasica media de los neutrofilos y este indice debe ser entre -10 y +10.

- Canal de basofilo / basofilia / nuclear,

analiza junto con otro canal, la formula leucocitaria . Canal basofilo se usa para medir y determinar la conformacion de los nucleos de las celulas blancas. Se basa en observacion de que cuando las celulas blancas se someten a la accion de un sulfactante especifico, las membranas y citoplasma de neutrofilos, eosinofilos, linfocitos y monocitos son eliminadas y por conseguiente, celulas ofrecen solo el nucleo desnudo; por el contrario las membranas de citoplasma de los basofilos permanecen intactas, lo que permite que se realice un recuento especifico de los basofilos.

Constan de 3 fases: 1. dilución de la sangre, 2. computo del numero de células, 3. calculo matemático del numero de células presentes en 1 mm3 de sangre.

Recuentos manuales en cámara de recuento o cuenta glóbulos o hemocitometro; tipos: Burker, Thoma y Neubauer.

Material:

-cámara de recuento

-cubreobjetos

-pipetas diluidoras de Thoma (para leucocitos) y de Potain (para hematies) de cristales que constan de un largo tubo capilar graduado y de una dilatación ampular o bulbo (dividido en 10 partes iguales y marcadas la 5ª con un 0,5 y la 10ª con un 1), el bulbo contiene una perla de vidrio (roja para el recuento de hematíes y blanca para el recuento de leucocitos) para facilitar la mezcla de la sangre con el liquido de dilución y acaba en un tubo capilar corto; la capacidad del bulbo es 100 veces superior a la del tubo capilar largo en las pipetas de hematíes (marca 101) y en las pipetas de leucocitos la capacidad del bulbo es 10 veces mayor (marca 11).

-goma de aspiración es un tubo de goma que permite la aspiración de la muestra y del liquido de dilución, encajada una boquilla en un extremo y se ensambla al tubo capilar corto por el otro.

-reactivos para el recuento de hematíes contienen cloruro sodico (isotónico para evitar la hemólisis) algún otro tipo contiene citrato sodico y antiséptico formalina; los mas utilizados es de Hayem;

-reactivos para el recuento de leucocitos contienen el acido acético glacial (sustancias tensoactivas/detergentes) que rompe los hematíes (una lisis previa de los hematíes) y colorante violeta de genciana que tiñe el núcleo de los leucocitos; los mas utilizados es de Turck;

-reactivos para el recuento de plaquetas incorporan sustancia hemolítica y un antiagregante plaquetario (oxalato de potasio).

-Dilucion de Hematies 1/200, de Leucocitos 1/20 y de Plaquetas 1/100

-muestra: sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA y diluida.

Recuentos en contadores electrónicos – componentes:

-diluidor: una solución isotónica con capacidad conductora.

-compresor-aspirador: aporta la presión y el vacío necesario para transportar la sangre.

-dispositivo de medida: es la cámara donde de cuentan realmente las células sanguíneas (cámara de medida o de lectura); sistema: detección celular por medida de la impedancia o ópticos de detección celular.

-transductor: transforma las señales, procedentes del dispositivo de medida, en impulsos eléctricos.

-discriminador: diferencia los impulsos eléctricos generados por cada uno de los tipos de células sanguíneas (en función del tamano, nucleo y enzima paroxidasa).

-lector: recoge los datos obtenidos, los procesa y los proyecta en una pantalla.

-registrador: imprime en el papel los resultados conseguido

Métodos electrónicos de recuento celular:

1-Método de la resistencia eléctrica o de la impedancia; descubierto por Coulter 1956 - el numero de señales eléctricas generadas (de la resistencia electrica y un cambio de potencial entre los electrodos) indica el numero de células presentes en la sangre y la amplitud de estas señales es directamente proporcional al volumen celular (detectadas y registradas por el aparato; debido que la naturaleza lipídica de la membrana (mal conductor) conducen mal la electricidad; el dispositivo de medida - un orificio de 100 lambdas de diametro a traves del cual se hace pasar la sangre diluida con un electrodo a su entrada y otro a su salida + corriente electrica constante de ese mismo orificio; otras marcas 70-100 lambdas hematies/plaquetas y 100-120 lambdas leucocitos.

2-Métodos de la dispersión de la luz o de la difracción (TECHNICON - mas caro): a. método del campo oscuro (el numero de señales luminosas detectado indica el numero de células presentes en la sangre, y la intensidad de la dispersión luminosa producida por cada una de ellas es directamente proporcional al tamaño de estas); > angulo -- > tamano de celula (la intensidad de la dispersion luminosa = tamano de las celulas y no.de senal = no. de celulas.  b. método del rayo láser (el numero de interferencias indica el numero de células presentes en la sangre y el grado de interferencia que produce cada célula a su paso es directamente proporcional a su tamaño); no.de interferencias = no.de celulas y grado de interferencias = tamano de celulas.

Parámetros que determina un contador electrónico:

Numero de hematíes, plaquetas y leucocitos por mm3 de sangre, porcentaje de reticulocitos, índices hematimetricos (eritrocitarios, reticulocitarios, leucocitarios y plaquetarios), valor hematocrito, concentración de hemoglobina en la sangre, velocidad de sedimentación globular.

Recuento de hematies - determinado por el numero de señales de paso celular registradas en la cámara de lectura de glóbulos rojos . En este recuento la sangre esta muy diluida. 

Recuento de reticulocitos – el único método automático que nos permite determinar el porcentaje de reticulocitos en la citometría de flujo que consta de tres sistemas principales (sistema hidráulico, óptico y informático); se tiñe el ARN (a través de la difracción de la luz absorbida, permite diferencia a los hematíes maduros de los reticulocitos. Citometro de flujo también efectúa medidas de absorción de la luz que hace posible diferenciar a los hematíes maduros de los reticulocitos (tamaño mas grande).

Citometria de flujo: un metodo analitico - se mide la emision del múltiples fluorescencia y la dispersión de luz LIGHT SCATTER de células / partículas microscópicas alineadas secuencial mente mediante una corriente liquida, laminar cuando son presentadas de 1 en 1 a gran velocidad (hasta miles de células/segundo) frente a unas de luz lazer de longitud de onda adecuada.

Recuento de leucocitos - es necesaria una lisis previa de los hematíes mediante sustancias tensioactivas (detergentes); el numero de leucocitos es determinado atendiendo al numero de senyales de paso celular, registradas en la cámara de lectura de leucocitos; la sangre no esta muy diluida.

Recuento diferencial leucocitario – la diferenciación entre los distintos tipos de leucocitos se realiza mediante distintas técnicas:

-resonancia magnética nuclear por Coulter

-rayo láser por CELL-DYN de LAB Abbott

-técnicas de difracción luminosa y absorción de luz láser que consigue el contenido en peroxidada de su citoplasma (Technicon)

-a traves del examen de frotis sanguineos tenyidos con coloracion panoptica, mediante microscopios especiales que incorporan sistemas de analisis computerizado de las celulas (automatizada).

Recuento de plaquetas - se cuenta en la cámara de lectura de los hematíes, debido su escaso tamaño producen senyales muy pequeñas y fácilmente distinguibles de las originadas por los hematíes. Sin embargos se puede dar confusiones en el caso de microcitosis; para facilitar el recuente plaquetario también es posible la separación de los hematíes por ejemplo mediante centrifugacion.

Factor de Corrección


CN (control normal) - Hb en la hoja de la casa comercial 13.9 +/- 0,5;  Coulter 14,2
factor de corrección CN:  13,9/14,2 = 0,97

CL (control low/patológico) - Hb en la hoja de la casa comercial 6,3;  Coulter 6,5
factor de corrección CL:  6,3/6,5 = 0,95

La media del factor de corrección:  fCN + fCL/2 = 0,97 + 0,95/2 = 0,96

Resultado de Muestra en Coulter: 15,5 ==> 15,5 x 0,96 = 15 resultado real.

Índices eritrocitarios (tradicionales):

1-Volumen Corpuscular Medio (VCM o en ingles MCV) – valor medio del volumen de los hematíes; se calcula a partir del hematocrito (HCT) y del recuento del numero de hematíes (RBC); 

VCM = HCT x 10    (+/- 60 lambdas, si no hay problema medular/ anemia)

             RBC

Valor normal 80-100 u3 (1u3 = 1 femtolitro = 10 _15 litros); menor de 80 fl = microcitosis (ferropenia, talasemia) y mayor de 100 = macrocitosis (carencia de vit B12 o acido folico, hepatopatias crónicas y reticulocitosis)

2-Hemoglobina Corpuscular Media (HCM en ingles MCH) – valor medio del contenido en hemoglobina en los hematíes ; se calcula a partir de la concentración Hb y RBC; 

formula: HCM = (Hb / RBC) x 10

Valor normal 27-31 pico gramos (1pg = 10_12 g); menor de 27 = hipocromia (macrocitosis) y mayor de 31 = hipercromia relativa (macrocitosis)

3-Concentración Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM en ingles MCHC) – el valor de la cantidad de hemoglobina (en g) contenida en 1 dl de hematíes (la cantidad de Hb); calculada a partir de la concentración Hb y del hematocrito (HTC); formula:

CHCM = (Hb / HTC) x 100

Valor normal 32-36 g/dl; mayor de 36 g/dl = hipercromia absoluta (esferocitosis hereditaria y deshidratación eritrocitaria o xerocitosis perdida excesiva de agua por parte del hematíe); disminución de CHCM = hidrocitosis o estomatocitosis congénita por la dilución del contenido hemoglobinico eritrocitario)

Nuevos índices eritrocitarios:

1-Índice de Distribución de los Hematíes (IDH) o Anchura de la Distribución Eritrocitaria (ADE) en ingles RDW o CV-GR – el coeficiente de variación (CV) de los volúmenes de los glóbulos rojos (GR), es un parametro estadistico que indica/ expresa el grado de dispersión existente entre los valores obtenidos (en este caso, entre los volúmenes de los hematíes evaluados); se calcula a partir de la desviación estándar (SD) y de la media de los valores obtenidos (en este caso de los volúmenes de los glóbulos rojos); formula: IDH = SD – GR x 100

                                                   VCM

Valor normal debe ser igual o inferior al 15% (indica la variación existente entre los tamaños de los hematíes); superior a 15% = anisocitosis (ferropenias y transfusiones)

2-Anchura de la Distribución de la Hemoglobina (ADH) o ET-Hb en ingles HDW – la desviación estándar de las concentraciones de hemoglobina de los hematíes, estima el grado de dispersión de los valores obtenidos (las concentraciones de Hb de los hematíes evaluados); 

formula: SD = V E (X – mx) 2

                               n – 1

X = cada uno de los valores obtenidos; mx = media de los valores obtenidos (CHCM);

n = numero de valores obtenidos.

Valor normal 2,2 – 3,2 g/dl; disminución ADH = hematíes hipo crómicos, el aumento ADH = hematíes híper crómicos; la separación del ADH de valor normal = anisocromia.

3-Índices reticulocitarios

Los modernos contadores hematológicos proporcionan:

-Volumen Corpuscular Medio de la población reticulocitaria (VCMr); su valor normal 101-119 fl

-Concentración Hemoglobinica Corpuscular Media de la población reticulocitaria (CHCMr); su valor normal 23 – 29 g/dl

-Coeficiente de variación del tamaño de los reticulocitos (RDWr)

-Desviación estándar de la distribución de hemoglobina en los reticulocitos (HDWr)

-Contenido de hemoglobina de la población reticulocitaria (CHr o HCr); su valor normal 25 – 30 pg; hay una correlación directa entre los niveles de hierro y el Chr (>Fe >Chr  indicador precoz y sensible de la disponibilidad de hierro, es útil en la valoración de enfermos crónicos; < 25 pg = debe instaurar un tratamiento con hierro.

Valor hematocrito (HTC) – calculada (indirecta); formula: HTC = (VCM x RBC) /10

Determinación de hemoglobina: se añade un agente lítico a la sangre completa diluida que rompe los hematíes y transforma la hemoglobina en cian metahemoglobina, la cantidad de cian metahemoglobina (+ reactivo ciannuro y detergente no ionico) se mide espectrofotometricamente; el método se puede emplear también en el recuento de leucocitos.

Velocidad de sedimentación globular (VSG) – metodo de antes: se mezcla la muestra ( 1,1 ml) con el citrato sodico (0,33 ml), se homogeneiza 10 minutos y reposar 30 minutos. Al cabo de este tiempo el censor luminoso lee el inicio de la columna de hematíes; actualmente: ya existen aparatos que miden VSG del tubo primario de EDTA.

FISIOLOGIA ERITROCITARIA

Eritropoyesis se produce en la capa endosito de la medula ósea roja en los huesos (adulto) del cráneo, clavículas, esternón, costillas, vértebras, la cintura pelviana y los huesos largos de las extremidades.

Fase de proliferacion y diferenciacion:

- Celulas madre pluripotentes o indiferenciadas (stem cells = celulas tronco) de 1er compartimento; de estas puede salir cualquier celulas en funcion de la presion ambiente (lo que demanda el organismo); morfologicamente irreconocibles; poseen marcador de membrana CD34; pueden formar colonias en cultivos celulares "in vitro"; capacidad de automntenimiento; CFU-LM ==> celulas madre linfoides (linfocitos) y cm mieloides (otras celulas).

- Celulas progenitoras comprometidas o precursores comprometidos (2nd compartimento de MO); morfologicamente indistinguibles; gran potencial de proliferacion;  tipos: CFU (colony forming unit) pude cultivarse y formar colonias y otro BFU (unidad formadora de brotes)

1. El precursor CFU-S (unidad formadora de colonias en el Bazo) o CFU-GEMM; se origina por diferenciacion de CFU-LM; se diferencia hacia precursores de la serie mieloide

2. El precursor BFU-EM; se origina por diferenciacion de CFU-GEMM; se diferencia hacia precursores eritrociticos o megacariociticos (compartida con trombocitos)

3. El precursor BFU-E; seorigina por diferenciacion de la celula BFU-EM; se diferencia hacia un precursor eritrocitico.

4. El precursor CFU-E; se origina por diferenciacion de BFU-E; se diferencia hacia proeritroblasto (1era celula morfologicamente reconocible; ocupan 3er comparimento de MO.

Fase de proliferación y maduración:

- El proeritroblasto o pronormoblasto o rubriblasto; se origina por diferenciacion de CFU-E; tamaño 20-25 micras, redondo ligeramente ovalado; nucleo grande en el centro de color violaceo rojizo; cromatina es laxa y homogenea, engloba de 2-5 nucleolos, algo azulados; citoplasma escaso de color azul intenso (muy basofilo) sin inclusion; se divide en 2 celulas

- El macroblasto; similar al proeritroblasto, menor tamano y estructura nuclear menos homogenea.

- El eritroblasto basofilo o normoblasto basofilo o prorrubricito; se origina por division y maduracion del proeritroblasto-macroblasto; tamano 15-20 micras redondeado; nucleo esferico, central y azulado /violeta; cromatina mas condensada con grumos no engloba nucleolos; citoplasma mas abundante, basofilo sin inclusion; se divide 2 veces sucesivas ==> 8 celulas

- El eritroblasto policromatofilo o normoblasto policromatofilo o rubricitico; se origina por division y maduracion del eritroblasto basofilo (16 celulas); tamano 8-12, redondeado; nucleo redondeado, central y azulado; cromatina fuertemente condensada en gruesos bloques de aspecto una mora o rueda de carro, no engloba nucleolos; citoplasma abundante azulado con matices rojizos (de Hb) sin inclusion; sin capacidad de division (empieza la maduracion)

- El eritroblasto ortocromatico o normoblasto o metarrubricito; se origina por maduracion del eritroblasto policromatofilo, tamano 7-10 micras, redondeado con limites poco definidos; nucleo pequeno, redondo, tendencia a excentrarse, color azul oscuro casi negro (casi muerto - necrobiotico); cromatina condensada con aspecto muy homogeneo, oscuro (picnosis nuclear); citoplasma abundante de color rojo con matices azules, a veces con granulos de hemosiderina (visibles mediante la tincion de Perls ==> sideroblasto VN 20-50% en MO); en su proceso de maduracion expulsa su nucleo y fagocitado por macrofagos de Sistema Mononuclear Fagocitico (SRE); se encuentran en MO, solo en sangre periferica en situaciones patologicas de metastasis en MO que rompen la barrera medular o hematopoyetica.

- El reticulocito; se origina por maduracion del eritroblasto ortocromatico, tamano 8-9 micras; sin nucleo (expulsado por e.ortocromatico); citoplasma con restos de ARN, tonalidad azulada, con restos de sustancia ribosomica y reticular (visible con tincion azul de cresil brillante ==> granulo filamentosa, se observa reticulocitos verde-azulados con sustancia granulofilamentosa de color negro-azulado); aun es capaz de sintetizar Hb (por tener restos de ribosoma); permanece 2-4 dias en MO y 1 dia en sangre periferica hasta terminar de madurar y se transforma en hematie VN 0,5-1,5% de total hematies circulantes.

Laxa ==> mas o menos condensada

Desarrollo – en condiciones normales la transformación de proeritroblasto a hematíe dura entre 7 y 9 días; un proeritroblasto  puede dar menos hematies de los previstos, porque algunas divisiones son abortadas (eritropoyesis ineficaz normal +/- 5%);  Proceso de maduracion: disminucion del tamano, descenso del tamaño núcleo celular hasta su perdida por expulsion, condensacion de cromatina nuclear (cada vez mas homogenea y basofila), aumento del volumen citoplasmatico, incrementacion de la coloracion rojiza (acidofilia) del citoplasma, por aumento del contenido Hb y disminucion del contenido ARN, desaparecion de las oganelas citoplasmaticas.

Regulación – regulada por dos tipos de sustancias: las cito quinas (de los linfocitos) y la eritropoyetina

Cito quinas o citocinas – producidas por los linfocitos T:

-LIF: promueve la proliferación de las stem cells embrionarias

-Interleuquinas 3 y 6 (IL-3 e IL-6) estimulan el crecimiento y la diferenciación de los precursores hematopoyéticos

Eritropoyetina o EPY o Ep o EPO – hormona generada por glicoproteína renal (factor eritropoyetico renal FER/ eritrogenina) y una globulina plasmática (de origen hepático); presenta acciones de inducir/facilitar el proceso eritropoyesis; estimulada por insuficiente oxigenación de los tejidos, estímulos hormonales (androgenos); su secreción se frena cuando existe una poliglobulia.

Eritrocinetica – entre 90 – 95% de todas las células sanguíneas son hematíes (4-5,5 millones /mm3 en las mujeres y 4,5 – 6 millones /mm3 en los varones); morfología (normocitos):

-tamaño 7 – 8 micras diámetro longitudinal, 2 micras diámetro transversal mayor y 1 micra diámetro transversal central), forma disco bicóncavo.

-carece de núcleo y organelas citoplasmáticas; citoplasma es rojizo homogéneo contiene hemoglobina.

-capacidad de elasticidad y deformación (viscoelásticas) para atravesar el filtro del SRE y la pierde al envejecer, atrapado por las aberturas de los sinusoides del SRE y destruidos por los macrófagos tras 120 días en el hígado y medula ósea; la destrucción de los hematíes anómalos se produce en el bazo.

-principal funcion es transporte de O2 y en menor medida de CO2, mediante Hb.

-eritron o eritrina: conjunto de hematíes circulantes (masa eritrocitaria) y sus precursores medulares; su homeostasis (estabilidad) esta autoregulada por el equilibrio entre sistema eritropoyesis y SRE.

Práctica XIII (recuento de hematíes o RBC red blood count)

Concepto: RBC ==> determinar el numero de hematies presentes en cada mm3 o microlitro de sangre)

Metodica: se diluye la sangre problema en un liquido Hayem, posteriormente se deposito en la camar de recuento Neubauer Mejorado.

Reactivos: liquido de dilución (debe ser isotónico con el plasma para evitar alteración y lisis) de Hayem o SSF.

Muestra: sangre venosa con EDTA; dilución 1/200 (10 lambdas de sangre + 1990 lambda de Hayem

Técnica: situar el cubre sobre el retículo de la cámara, se desliza presionando ligeramente sobre las bandas laterales y humedecidas con Bau de su porción central; depositar una gota entre la cámara y el cubre ayudados de un capilar de hematocrito; dejar reposar unos minutos para sedimentarse, observar con el objetivo de 10x para ver la homogeneidad (una vision global); enfocar con el objetivo de 40x, el condensador a media baja altura, verificar que la distribución de los hematíes es homogénea; contar los hematíes en 80 cuadrados pequeños del cuadrado grande central (4 cuadrados medianos de las esquinas y del centro) ==> 5 cuadrados medianos x 16 cuadrados pequenos; para evitar contar repetidamente, solo se cuentan los que están contenidos dentro del cuadrado y los que están en contacto con sus líneas de demarcación superior o izquierda y sigue el orden en zig-zag.

Lectura: el cuadro grande central tiene 25 cuadrados medianos (multiplica por 5); los lados del cuadrado grande central es de 1 mm y el espacio entre el retículo y el cubre es de 0,1 mm (multiplica por 10); si la dilución se añade a partir de 1, multiplicar por 100 y si se hace a partir de 0,5 se multiplica por 200. RBC = H x 5 x 10 x D (100 o 200).

El margen de error de esta técnica es alto (20%); disminución RBC = anemias y aumento = policitemias.

RBC valor normal = 3,8 - 5 millones / mm3 en mujeres y 4,5 - 5,5 millones / mm3 en varones.

Practica XIV (determinación del valor hematocrito HTO o HTC o HCT mediante el micro método)

Fundamento: HCT==> la relacion existente entre el valor ocupado por celulas formes y el ocupado por la sangre total, expresada en %;  no es exactamente igual en todas las zonas vasculares del organismo (HTC capilar 5% > HTC venosa); se determinar por métodos manuales (1-2 unidades mas alto porque se cuenta leucocitos, plaquetas y el plasma atrapados entre los hematíes): centrifugación de 10.000 g (micro método – mas utilizado) o métodos automáticos /prueba counter (mas exactos con 0,01 % de error): calculo matemático a partir de RBC y VCM y análisis de la sombra en un campo oscuro.

Material: tubo capilares de vidrio (1 mm de diámetro 7,5 cm de longitud) heparinizados para sangre capilar o no si es sangre venosa; plastilina, algodón o gasas, centrifuga micro hematocrito 10.000 g mas utilizado, regla milimetrada o lector de micro hematocrito.

Reactivos: EDTA tri potásico dispuesto en tubos (para sangre venosa)

Muestra: sangre capilar (se echa la primera gota obtenida tras la punción) o venosa (en tubo con edta se homogeneiza bien antes de usar). Errores ==> la sangre con EDTA empieza a sedimentar;

Técnica: La determinación ha de hacerse por duplicado (usando 2 tubos por fiabilidad de los resultados). Llenar cada tubo con sangre ¾ partes de su longitud, sellar el extremo con plastilina, colocar equilibradamente en la centrifuga para conservar el eje de la centrifuga (evitar averia), centrifugar 10.000 durante 5 minutos. Una vez centrifugado, medirlo rápido para que no se mezcle. Si hay burbujas, se deseche y volver a repetir; no se cuenta el sobrenadante de leucocitos. 

Lectura: Medir las columnas formadas con regla milimetrada y el porcentaje de eritrocitos que corresponde. Entre los 2 tubos no debe haber una diferencia superior al 2% o la media no >50; si lo hay, se repite la determinación centrifugando a 10 minutos mas. Valor normal HCT 35-45% en mujeres, 43-55% en varones, en recién nacidos 56%, niño de 1 año 35%, niño de 10 años 37% - valores de referencia igual que un adulto; (disminución = anemia, hemorragias, embarazo y aumento = poli globulina transitoria o patológica, patologia renal, plicitemia y poliglobulia relativa); falsos descensos en hemodilucion/ aumento en la cantidad de plasma, pero los hematíes quedan igual (hidremia del embarazo); falsos ascensos en hemoconcentracion (deshidratación - deportistas).

Causas de error: la sangre no es reciente; que haya sedimentado (a los 10 minutos - agitar); error en la medición (contar leucocitos o tubo es sucio); plastilina mal puesta (extra vasación); tubo mal puesto en la centrifuga (rotura); tubo roto (limpieza centrifuga de cristal y sangre); centrifuga mal calibrada;

Practica XV (alteraciones del hematocrito con la concentración de anticoagulación)

La relacion optima de anticoagulante / sangre de be ser de 1/10 para muestras con valor hematocrito normal; si usamos anticoagulante que necesita cantidad, puede afectar el resultado del hematocrito (aumenta en plasma); heparina se usa muy poca cantidad; edta son los mejores para no alteran el hematocrito; si HCT <, anticoagulante > (+ plasma  + factores de coagulación  + coagulante) y cuando HCT >, anticoagulante <.

Se observa una disminución de HCT a medida que s aumenta la concentración de anticoagulante en la muestra; esto se debe al aumento de la presión osmótica fuera del hematíe, con lo que sale liquido del interior celular y disminuye su volumen (el grado de empaquetamiento de los hematíes es mayor y el HCT es menor).

Practica XVI (recuento de reticulocitos)

Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros con tamaño de 8-9 u de diámetro que contienen un retículo o red cromatinica formada por restos de ARN (ribosomas - donde se forman la globina de Hb), mitocondrias (donde se sigue formando todavia protoporfirina IX - parte de HEM) y otros órganos celulares; permanecen en medula ósea unos 2-4 días y salen a sangre periférica donde terminan de madurar en unas 1-2 dias; su cantidad en sangre periférica es un reflejo de la actividad eritropoyetina medular (0,5 - 1,5%).

Fundamento

- Podemos observar los reticulocitos mediante la tinción con colorantes vitales, azul de metileno nuevo o azul de cresil brillante que causa la precipitación de los restos de ARN y se observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la célula;

- Si acaba de salir de MO la red es mas compleja; 1-4 días van desapareciendo (nos indica la maduración); el numero de reticulocitos nos indica: que la eritropoyesis es funcional, para dosificar las anemias en regenerativa o arregenerativas; para verla eficacia de los tratamientos con vitamina B12. 

- Si hay aumento de reticulocitos y no hay anemias, ni hemorragias visibles  esta perdiendo sangre en algún sitio (hemorragias internas) como en ulceras digestivas son las + frecuentes en hemorragias ocultas.

Material: microscopio óptico, reactivo de azul de cresil brillante, pipetas automaticas, portas, baño de agua, o estufa 37oC.

Muestra: sangre anticoagulada con EDTA; los reticulocitos también maduran in Vitro, por esto es aconsejable que la muestra es recientemente extraída (máx. 6 horas antes de su análisis, mejor en 1ª y 2ª hora)

Técnica:  el colorante viene preparada; es una tincion supravital (se hace mientras las celulas aun estan vivas); al tubo de reactivo preparado, echamos 3 gotas (150 lambdas) de sangre total, mezclamos suavemente, tapamos con papel para film e introducimos en el baño de agua a 37ºC durante 10-15 minutos (o incubar en el espectrofotómetro); pasado este tiempo volvemos a homogeneizar y tomamos una gota de la suspensión y depositarla en un porta, realizamos una extensión y dejamos secar al aire; observamos la extensión con una gota de aceite de inmersión con el objetivo de 100 x; elegir una zona, contar 100 hematíes.

Lectura: los hematíes se tiñen de color verde azulado y los reticulocitos se diferencian con unos hilos finos (granulocitos) de color azul en su interior; contar 1000 hematíes en total y calcula el porcentaje de reticulocitos con la formula:

% reticulocitos = nº de reticulocitos contados x 100

                             nº de hematíes contados

Para descartar errores, debemos realizar 2 extensiones y hacer el recuento en ambas y la diferencia entre ellas sea igual o menor a 5 reticulocitos o 1,5% (el resultado final es la media de los dos porcentajes obtenidos).

Valores normal en adultos y niños 0,5 – 1,5 % o 35.000-80.000/mm3 de sangre; disminución (reticulopenia = aplasia medular, anemia ferropénica, anemia megaloblástica (falta de acidofolico) y anemias con dificultad en la eritropoyesis; aumento (reticulocitosis = anemia hemolíticas y post-hemorrágicas donde se aumenta la producción de hematíes para contrarrestar su perdida); y tambien en el inicio del tratamiento de las anemias ferropenicas y megaloblasticas;

Cuando < hematíes por anemia, > la producción reticulocitos; la corrección se hace en base al valor hematocrito del paciente y se calcula:

% de reticulocitos corregido = % reticulocitos x HCT paciente

HCT normal (45%)

Causas de errores del contaje:

- recuento insufficientes de hematies o de reticulocitos.

- confundir reticulocitos con cuerpos de Heinz (puntos purpureos oscurros) /bolitas pegadas a la membrana; consecuencia de patologia de hematies por deficiencia de una enzima glucosa 6Pato deshidrogenasa.

- confundirlos con corpusculos de Hb (punteado basofilo) en patologia alfa talasemia y Hbpatia o restos de Hb desnatura, lizada por el azul de cresil y aparecen como granulos azul verdosos a las 3 horas de incubacion y se observan en la mayor parte de los hematies de la extension.

Desviación reticulocitaria – un periodo de maduración intramedular mas corto y una etapa de maduración en sangre periférica mas larga de reticulocitos (cuando el HCT muy bajo, la MO intenta compensar reduciendo el tiempo de maduración intramedular, por lo que tardara  + días en madurarse en sangre periférica); se observa en el frotis como hematíes grandes con un color azulado (macrocitos poli cromáticos).

Índice de producción reticulocitaria (IPR) – una segunda corrección del % reticulocitos en función de los días que tarda en madurar en sangre periférica con la formula:

IPR = % reticulocitos corregido

           Días de maduración en sangre periférica

IPR mayor de 3 = aumento de la actividad eritropoyetica medular; IPR menor de 2 = escasa actividad eritropoyetina.

Los días que tarda en madurar el reticulocitos:

HCT del paciente: 45 35 25 15 

Tiempo de maduración: 1 1,5 2 2,5

En hemorragia muy importante hay que mantener la volemia, evitar el estado de shock con el suero, sangre y O2 para evitar infarto por disminución de volemia. La MO reacciona produciendo reticulocitos inmaduros.

HEMOGLOBINA

La hemoglobina o Hb o HGB – un cromoproteido se encuentra en el interior del hematie, 97% de su peso seco y encargado del transporte de O2 desde los pulmones a los tejidos; constituido por 2 porciones: un grupo prostético (no proteico) HEM o HEMO que proporciona el color de sangre y un grupo proteico globina (sin color/ incoloro). 

HEM consta de 4 ferro porfirinas idénticas; cada una esta compuesta por una protoporfirina IX / 4 pirroles y un átomo de hierro ferroso (Fe++) en el centro; De las 6 valencias de Fe, 4 se unen a los atomos N2 del grupo pirrol y otros 2 quedan libres para unirse a la cadena de globina y unirse al O2). 

La globina consta de 4 cadenas polipeptídicas, iguales 2 a 2 (e.j. 2 alfa y 2 beta en HbA de los adultos) y cada una esta constituida por algo más de 140 aminoácidos. Cada cadena polipeptídica de la globina se engarza a través de un aminoácido histidina, al átomo de hierro de su ferro porfirina correspondiente.

Cadenas de globina: cadena alfa (141 aa), beta (146 aa), gamma, delta Epsilon, Gy (c.gamma con glicina), Ay (c.gamma con alanina). Al combinarse entre si, darán lugar a las diferentes clases de Hb que irán variando a lo largo de desarrollo humano.

Síntesis – empieza de forma apreciable, en el eritroblasto policromatofilo y alcanza un nivel máximo en el reticulocitos; su síntesis comienza en las mitocondrias, con la condensación del aminoácido glicina y de succinil-coenzima A procedente del Ciclo de Krebs, en presencia de fosfato de piridoxal (Vit. B6) y bajo la acción de la encima ALA-sintetasa, para formar el ácido delta-aminolevulinico (ALA).

El hierro se inserta en la molécula de protoporfirina IX mediante una enzima mitocondrial (ferroquelatasa) y se termina la sintesis de la ferroporfirina. El Fe se incorpora en estado ferroso y se penetra mediante la transferrina en el eritroblasto.

Todas las cadenas de globina se forman en los ribosomas; el engarce de una cadena de globina con su ferroporfirina correspondiente da lugar a una sub unidad de hemoglobina. La conjunción de 4 de estas sub unidades da lugar a la hemoglobina propiamente dicha (e.j. 2alfa + 2 betas). El aumento de la concentracion del grupo HEM estimula la sintesis de globina.

La estructura terciaria de las cadenas de globina, forman una cavidad donde se instala el HEM y la unión de HEM a cada cadena polipeptidica, se hace atraves de las valencias de unión de Fe y por otros puntos de anclaje mediante algunos amino ácidos de la proteína. HB pesa 67.000 daltones y tiene estructura 3 dimensional.

Resumen del síntesis Hb (ocurre en las mitocondrias) desde eritroblasto policromatofilo - reticulocito:

Succinil-Coa (procedente del ciclo de Krebs) + ALA-sintetasa + B6 + aa.Glicina ==> 4 Pirroles ==> Protoporfirina IX + Fe (ferroso) a través de la transferrina + ferroquelatasa ==> Ferroporfirina + cadena de globina - alfa,beta,delta,gamma,epsilon (se forman en los ribosomas) que contiene cada uno > 140aa - se unen a través de aa histidina al Fe (ferroso) ==> subunidad Hb x 4 (2alfa y 2 beta)

Tipos:

-Hemoglobina A (Hb A): 2 cadenas alfa y 2 betas; la mayoría en adulto 97% de total

-Hemoglobina A2 (Hb A2): 2 cadenas alfa y 2 delta; en el adulto 2,5% de Hb total

-Hemoglobina Fetal (Hb F): 2 cadenas alfa y 2 gamma; es la mas abundante en cuarto mes del embarazo – los 6 meses; en pequeño porcentaje se encuentra en el adulto.

Mayoritarias en el embrión:

-Hemoglobina Portland: 2 cadenas dzeta y 2 gamma

-Hemoglobina Gower I (Hb GI): 2 cadenas dzeta y 2 epsilon

-Hemoglobina Gower II (Hb GII): 2 cadenas alfa y 2 epsilon

Función – (1) transportar O2 desde los alvéolos pulmonares hasta los tejidos; puede transportar máx.4 moléculas de O2 (Hb saturada) cuando el valor de PO2 es elevada; oxihemoglobina (Hb-O2) predomina en la sangre arterial y desoxihemoblogina o Hb reducida (Hb-red / Hb libre / HbsinO2) predomina en la sangre venosa. El grado de saturacion de Hb depende de la pO2 (presión parcial de oxigeno) en el medio. pO2 en los alvéolos:  100 mmHg (98% saturada)

Factores que disminuyen la afinidad de la Hb por el O2: temperatura alta, disminución del pH del medio (efecto Bohr), elevación de CO2 en el medio, la presencia en el medio de un metabolito de la glucólisis 2,3 bifosfoglicerato (2,3 BPG). Aumento de 2,3 BPG = descienda la afinidad de la HB por el O2 = liberación de o2 a los tejidos (oxigenación). 

Hb F (infant, hasta 6 meses) tiene mas afinidad por el O2 que la Hb A (adulto) = captacion por el feto de O2 presente en la Hb materna; en condición normal, debido a la enzima diaforasa (NADH-metahemoglobina-reductasa) ==> 99% de Hb se une al Fe ferroso o reducido (Fe++) y 1% al Fe ferrico u oxidado (Fe+++) = metahemoglobina; en condición patológica, metahemoglobina se eleva a > 10% y aparece una coloración azulada de la piel (falsa cianosis - por no poder fijar a O2). No hay que confundir con cianosis verdadero (aumento de la Hb-red en la sangre capilar por enzima de los 5 % lo que se da en la anoxia o otras circunstancia (genosis??).

(2) Transporte del CO2 por a Hb o en el plasma (en forma bicarbonato) desde los tejidos hasta los alvéolos pulmonares, contribuye a la regulación del pH sanguíneo; Hb que transporta el dióxido de carbono (carbaminohemoglobina Hb-CO2) da un color algo mas oscuro que normal y contribuye a la regulación del pH sanguíneo; mayor parte de CO2 es transportada en forma de bicarbonato (HCO3-);  la unión entre CO (monoxido de carbono) y Hb es mas fuerte que con O2 (patológico) ==> HbCO (carboxihemoglobina) que confiere una coloración de la piel rojo cereza (contrasta con el estado de asfixia que origina).

Catabolismo – tras destrucción de los hematíes por los macrófagos en SRE, Hb es catabolizada:

-la globina se desdobla en aminoácidos, forma parte de la reserva y posteriormente son reutilizados.

-el hierro se almacena temporalmente como ferritina por los macrófagos, captado por la transferrina plasmática y transportado a MO para su reutilización.

-la protoporfirina IX (HEM) se transforma en bilirrubina indirecta, pasa al plasma, captado por el hígado que la conjuga con acido glucoronico (forman bilirrubina directa) y la elimina através de la bilis hacia el intestino.  

La bilirrubina directa liberada en el intestino, sufre 2 procesos:

1- Reabsorbida a la sangre y eliminada por via renal (urobilinogeno/pigmento - da color ambar a la orina) ==> urobilina.

2- Degradada por las bacterias intestinales a formar esterco bilinogeno que le da el color a las heces ==> estercobilina.

Ademas Hb que accede a la plasma que es mínima en condición normal. En caso de hemolisis es grande, captada por una proteína alfa 2 globulina (haptoglobina) y la lleva hasta SRE para evitar ser filtrada por el rinyon y por lo tanto eliminado por la orina. En estado de hemolisis, las haptoglobinas no pueden transportar todo la HB, por esto existe hemoglobinuria.

Resumen (destruccion de Hb en SRE - MO, Higado (normal) y Bazo (anomalos):

- Globina ==> reserva aa ==> reutilizados en MO

- Fe ==> reserva ferritina en SRE/macrofagos + transferrina plasmatica ==> reutilizacion en MO

- Protoporfirina IX ==> bilirubina indirecta desde sangre hacia higado + acido glucuronico ==> bilirrubina directa, eliminada atraves de bilis ==> intestino (pasa a la sangre, eliminado por via renal/ urobilinogeno ==> urobilina o degradada por bacteria del intestino/esterco-bilinogeno ==> estercobilina).

Practica XVII (determinación de hemoglobina en sangre)

Parte del diagnostico de las anemias (recuento de hematíes, HCT, Fe, Hb), se recomienda el método colorimétrico de la cian metahemoglobina por su exactitud y precisión; el método de la oxihemoglobina (HbO2) es mas rápido y simple, pero no tiene patrón y no es estable. El método colorimétrico se basa en la transformación de la hemoglobina en cian metahemoglobina mediante los siguientes pasos: Fe2+ +hemoglobina + ferricianuro potasio (Drabkin)  Fe3+ +hemoglobina (metahemoglobina) + cianuro potasio  cian metahemoglobina estable con absorción máximo a 540 nm (cuanto + Hb  + cianmetahemoglobina)

Material: tubos de ensayo, cubetas, pipetas de seguridad, espectrofotómetro o foto colorímetro, cubetas para colorimetría.

Reactivos: Drabkin (ferricianuro potásico 20 mM, cianuro potásico 43 mM, conservantes y estabilizantes), estándar (cianmetahemoglobina) = a 20g de Hb /dl.

5ml de Drabkin + 20 lambdas de sangre (0,02 ml) o 2,5 ml de Drabkin + 10 lambdas de sangre (0,01 ml)

Muestra: sangre total anticoagulada con heparina o EDTA.

Técnica: cubeta BR/blanco reactivo (2,5 ml de reactivo), ST (2,5 ml), PR/problema + reactivo (10 lambdas de muestra + 2,5 ml reactivo), CN y CP (2,5 ml de reactivo + 10 lambdas de los controles); incubar 10 minutos a temperatura ambiente; pipetear  siempre agitar la solución y siempre limpiar la punta; posibles errores:

-pipeteo incorrecto (de la sangre, sobre todo, porqué es muy pequeña la cantidad

-que la sangre no sea reciente

-que la longitud de onda no sea la adecuada (540)

-que las proporciones sean incorrectos (2,5ml/0,01 ml o 10 lambdas)

-caducidad de reactivos

-tubos sucio o manipulado o rayado (cubetas) no clara la lectura adecuada

-que hayamos esperado mucho tiempo para hacer la lectura (la reacción de la sangre con el Drabkin es de 8 horas).

Lectura: se hace la lectura de la absorbancia (DO) en las cubetas foto colorimetría a 540 nm; Cálculos:DO PR x 20 = g de hemoglobina / dl

DO ST

Valores normales hombres: 14-18 g/dl, Mujeres 11-16 g/dl, Niños 10-14 g/dl

INDICES ERITROCITARIOS o
INDICES HEMATIMETRICOS o
INDICES CORPUSCULARES

Son una serie de parametros que expresan diferentes caracteristicas de los hematies; Los tradicionales (secundarios) se calculan a partir de los valores obtenidos de RBC (mm3), de HCT (%) y Hb (gr/dl).

a.Volumen Corpuscular Medio (VCM) - valor medio del volumen de los hematies HCT/RBC x 10;
Valor normal 80-100 u3 (u3=1 femtolitro=10 -15 litros); menor ==> microcitosis (a.ferropenica y talasemia);  mayor ==> macrocitosis (deficit vit.B12 o acido folico en hepatopatas cronicas y reticulocitosis);

b.Hb Corpuscular Media (HCM) - valor medio del contenido en Hb de los hematies Hb/RBC x 10; Valor normal 27-31 picogramos (1 pg = 10 -12 g);  menor ==> hipocromia y microcitosis;  mayor ==> hipercromia relativa y macrocitosis.

c.Concentracion Hbica Corpuscular Media (CHCM) - la cantidad de Hb en gr contenida en 1 dl de hematies Hb/HCT x 100; Valor normal 32-36 g/dl;  mayor ==> hipercromia absoluta;  disminucion ==> hidrocitosis o estomatocitosis congenita (dilucion del contenido Hbico eritrocitarios);  aumento ==> esferocitosis hereditaria (disminucion de la relacion entre la superficie y el volumen eritrocitario) y deshidratacion eritrocitaria o xerocitosis (perdida excesiva de agua por parte del hematie).

Nuevos indices eritrocitarios
a.Indice de Distribucion de los Hematies (IDH/ADE/RDW) - indica la variacion existente entre los tamaños de los hematíes; el coeficiente de variacion de los volumenes de los hematíes; expresa el grado de dispersion existente entre los volumenenes de los hematies evaluados; valor normal =/< 15%;  mayor ==> anisocitosis (en periodos iniciales del tratamiento de las ferropenias, fases inmediatas a la administracion de transfusiones y cuando haya alteracion medular).

b.Anchura de la Distribucion de la Hb (ADH/HDW) - desviacion estandar de las concentraciones de Hb de los hematies; el grado de dispersion de las concentraciones de Hb de los hematies evaluados; valor normal 2,2 - 3,2 g/dl; disminucion ==> hipocromicos;  aumento ==> hipercromicos; separacion ADH de sus valores normales ==> anisocromia (hematies de diferente color).

HIERRO

Utilidad – importante en metabolismo celular; es elemento integrante de la estructura de proteínas fundamentales: mioglobina del músculo, citocromo, hemoglobina de los eritroblastos y enzimas: catalasa, peroxidadas; necesidad diaria de hierro 0,7-1 mg/dia (hombre)  1-1,2 mg/dia (mujer) (aumentan en el embarazo, menstruación, lactancia y la pubertad); dieta normal diario aportan 10-30 mg en forma de complejos ==> Fe3+ (digerido), absorbido por el duodeno: 5-10% en forma de Fe2+ (reducción/ferroso) con ayuda de HCL gástrico y vitamina C (proceso de reducción), el resto se elimina con las heces. Atravesar las células intestinales y transportado hacia el torrente sanguíneo, se transforma a F3+ (proceso de oxidación) para ser recogido por un tercio parte de la transferrina plasmática o siderofilina (beta globulina), de allí se distribuye por todo el organismo; en condicion normales 1/3 de la transferrina esta saturada de Fe; pequenya parte se une a la apoferritina ==> ferritina (hidrosoluble) al nivel de SRE (MO, Higado y Bazo);  si la apoferritina es baja (insuficiente) ==> en forma de hemosiderina  (compuesto insoluble amorfo).

El hierro se pierde diaria 1 mg (exfoliación células cutáneas y mucosas, eliminación sudor y bilis) y 1 mg mas en el embarazo, la lactancia y menstruación). Los valores normales de sideremia: (concentración plasmática de hierro) 60-160 ug/100ml en el varón y 37-145 ug/100 ml en la mujer.

Los valores normales de transferrina en sangre: 200 -350 mg/dl.

Déficit de hierro – la cantidad ttl de Fe por debajo de los limites normales; 1a fase - agotamiento ferrico al nivel de la reserva (Hb y Fe serrico son normales); 2a fase - periodo sub clinico / asintomático  (Fe serico y saturacion de transferrina son bajos);  3a fase - el cuadro de anemia ferropénica (la producción limitada de eritrocitos por la disponibilidad de hierro en el plasma); causas:

-Dieta: ingesta insuficiente carne y el consumo inhibidores de la absorción del hierro como maíz o te).

-Absorción insuficiente de hierro: cirugía gástrica o mal absorción intestinal.

-Pérdidas de hierro: sangrado gastrointestinal (varices esofágicas, hernia de hiato, ulcera péptica, gastritis, hemorroides o neoplasia del tubo digestivo); en las mujeres: menstruaciones abundantes, abortos consecutivos.

-Necesidades aumentadas: la infancia (crecimiento), el embarazo y la lactancia.

Sobrecarga de hierro – aumento en cantidad de Fe plasmático (a) por una absorción intestinal mayor de lo normal (defecto congénito) puede causar hemocromatosis idiopática con lesiones orgánicas en el tejido epitelial y hepático; (b) otras causas: transfusiones sanguíneas múltiples (siderosis transfusional), absorción intestinal de hierro excesiva y eritropoyesis ineficaz (anemias sideroblasticas), aumento en la liberación de hierro en el higado (hepatopatia aguda con necrosis de los hepatocitos), aumento de la destrucción de eritrocitos al nivel SRE (anemias hemolíticas).

Mala movilización del hierro almacenado en el SMF.
En un proceso inflamatorio o infeccioso se produce un aumento de interleuquina-1 (IL-1) y otras citoquinas producidas por los macrófagos activados. La IL-1 es la responsable en los hepatocitos del aumento de los reac-tantes de fase aguda (uno de ellos, la alfa1 antitripsina dificulta la unión de la transferrina a sus receptores en los precursores eritroides) y de la disminución de la transferrina y albúmina. En los macrófagos origina un aumento de la síntesis de ferritina con el consiguiente incremento de la capacidad de depósito de hierro, de la actividad fagocítica de los macrófagos y de su activación con mayor secreción de IL-1.
La acción de la IL-1 sobre los granulocitos aumenta la liberación de lactoferrina. Es una proteína similar a la transferrina y con mayor afinidad por el hierro. Pero el hierro unido a la lactoferrina no se transfiere a los precursores eritroides y se acumula en el SMF; debido a esta captación de hierro, la concentración sérica disminuye. Se cree que es un mecanismo de defensa frente a infecciones que depriva a los microorganismos del hierro que necesitan para proliferar.

Métodos de determinación (5)– parámetros del metabolismo del hierro que sirve para diagnosticar la patología subyacente.

1.Sideremia: la concentración de hierro presente en el suero (hierro serico) – se determina por colorimétrico (separar el hierro de la transferrina y reaccionar con sustancia cromogenica (derivado de la fenantrolina - ferrozina), se mide con espectrofotometro; hiposideremia (valores por debajo) en la anemia ferropénica, síndromes inflamatorios crónicos y procesos neoplásicos avanzados; hipersideremia (v. por encima) en sobrecarga de hierro: hemocromatosis idiopática, anemias sideroblasticas (eritropoyesis ineficaz), anemias hemolicas y hepatopatias agudas o crónicas (Fe no se almacena bien); valor normal varón 60-160 ug/100ml, mujer 37 - 145 ug/dl (max.150 ug/dl para ambos).

2.Capacidad total de fijación del hierro (CTFH): cantidad total de hierro que puede captar la transferrina (hierro circulante en el plasma unido a la transferrina; cada gr de transferrina es capaz de fijar 1,25 mg de Fe; normal: 1/3 transferrina saturada de hierro ==> cada molecula de transferrina transporta 2 moleculas de Fe) – consiste en añadir +Fe (excesivamente) al suero problema ==> saturar la transferrina ==> el sobrante de Fe + un quelante (carbonato de magnesio) para eliminar el exceso ==> medir la sideremia con el espectrofotometría; valores normales 250-400 ug/100ml (un triple de sideremia normal - el calculo para hayarlo es CTFH = transferrinemia x 1,25); valores aumentado en deficiencia de hierro, anemia ferropénica o hepatopatias agudas y valores disminuidos en sobrecarga ferrica, procesos crónicos y perdida generalizada de proteínas y transferrina en síndrome nefrítico.

3.Porcentaje de saturación de la transferrina – transferrina plasmatica 200 - 350 mg/dl (la media de 250 mg/dl) juntos con la sideremia y CTFH es fundamental para un diagnostico diferencial entre ferropénica verdadera y pseudoferropenia (por defecto en utilización hierro de reserva); formula:

% de saturación = sideremia (normal) x 100

                                           CTFH (sideremia en condición transferrina saturada)

valores normal 25 – 45% (varón) y 20 -35% (mujer); aumentados en sobrecarga de hierro, disminución de la formación de eritrocitos por deficiencia de vitamina B6 o perdida de proteínas en el síndrome nefrótico; disminuidos en deficiencia de hierro (anemia ferropénica) o procesos crónicos.

4.Tinción de Perls (azul de Prusia) – pone de manifiesto la presencia de hemosiderina (un compuesto insoluble amorfo) en el citoplasma, se emplea fundamentalmente sobre frotis de MO para localizar depósitos de hierro no heminico (no pertenece al grupo prostetico/ no unido a Hb) en las células del sistema mononuclear fagocítico / SRE (macrófagos histicos) y en eritroblastos (sideroblastos); la hemosiderina se aprecia, dentro de las células, como gránulos de color azul-verdoso.

5.Ferritinemia – cantidad de ferritina/circulante en el suero (pequeña cantidad de Fe3+ absorbido + apoferritina ==> ferritina en SRE), sirve para cuantificar el nivel de reservas de hierro en el organismo (evitaría una punción MO para hacer la tinción de Perls); compuesto hidrosoluble de hierro trivalente (pasa a la sangre) que se une a una proteína apo ferritina, como reserva en el hígado, MO y bazo; la determinación sirve para cuantificar el nivel de las reservas de Fe en el organismo y puede suplir la punción medular en tincion de Perls; se utilizan técnicas inmunológicas de marcaje radiactivo, tipo RIA e inmuno ensayos con enzimas fijadas, tipo ELISA; valores normal 30-150 ug/l en el varón y 20-150 mg/l en la mujer; valores aumentados en sobrecarga férrica (hemosiderosis) y inflamación cronicos y neoplásicos; valores disminuidos en la anemia ferropénica / carencia de Fe (< 12 ug/l).

Practica XIX (determinación de la sideremia)

Fundamento: el hierro ferrico (Fe3+) presente en la muestra y unido a la transferrina es liberado por el guanidinio  hierro ferrico libre es reducido a ferroso (Fe2+) por la hidroxilamina  reacciona con ferrozina forma un complejo coloreado (la intensidad de formación es medida espectrofotometricamente.

Material: 4 tubos de plástico de un solo uso, un rotulador de vidrio, 2 pipetas graduadas de 1 ml, 1 pipeta automática capaz de dispensar 200 ul, puntas de pipeta automática, 5 cubetas de espectrofotometría, un espectrofotómetro.

Reactivos: 1-Cloruro de guanidina 1M, Hidroxilamina 0,6 M, Tampón acetato 0,4 M (evitar el contacto con la piel y los ojos – irritante); 2-ferrozina 40 mM; 3-Reactivo de trabajo = reactivo 1 + reactivo 2, se agita suavemente (estable 6 meses a 2-8 ºC); patrón de hierro (solución de hierro) concentración 100ug/dl; agua destilada;

Muestra: suero o plasma heparinizado

Técnica: todos los reactivos, el patrón (St) y la muestra a temperatura ambiente o a 37º, rotular 4 tubos de ensayo BR (blanco de reactivo: agua destilada 200ml + reactivo de trabajo 1 ml), St (patrón/estándar: solución patrón 200ml + reactivo de trabajo 1 ml), BPR (blanco de muestra/problema: muestra 200ml + reactivo 1 – 1 ml) y M (muestra/ problema: muestra 200ml + reactivo de trabajo 1 ml); agitar el contenido de todos los tubos, dejar que reaccionen 5 minutes a temperatura ambiente, ajustar el espectrofotómetro a 560 nm, leer la absorbancia (A) del tubo BM , después leer tubos P, M y BR.

Lectura:

Sideremia (ug/dl) = A muestra – A blanco de muestra x concentración del patrón (200)

                                  A del patrón (St)

con esta técnica, los valores normales mujeres 55-140 ug/dl, varones 70-155 ug/dl

ALTERACIONES DE LOS HEMATIES

Alteraciones del tamaño – hematíes normociticos tiene diámetro longitudinal 7-8 u, diámetro transversal (espesor) periférico 2u, central 1u, superficie 120-140 u2, volumen 80-100 u3.

1-Anisocitosis: coexistencia de distintos tamaños de hematíes en la misma muestra de sangre. E.j. pacientes transfundidos / poli transfundidos y a.megaloblasticas (déficit vit.B12 o ácido folico)

2-Microcitosis: diámetro longitudinal < 7u y volumen < 80u3; casi siempre denota escasee de Hb, que presenta halo claro, central, aumentado con una transición suave de color hacia la periferia. (talasemias por alteración de Hb, a.sideroacresticas por alteración den la movilización del Fe y a.ferropenicas.

3-Macrocitosis: diámetro longitudinal > 8u y volumen > 100u3; el contenido de Hb es normal (alcoholismo y hepatopatias crónicas y a.megaloblasticas)

4-Megalocitocis: diámetro longitudinal > 11u; fisiologicamente se produce en la época embrionaria (a.megaloblástica)

Alteraciones de la forma – hematíes normociticos tienen forma disco bicóncavo.

1-Acantocitosis: hematíes con espículas de longitud y posición irregular/acantocitos (abetalipoproteinemia – mal absorción de grasas y cirrosis hepática)

2-Dianocitosis: hematíes planos, en forma de diana y sombrero mejicano/ dianocitos, cuyo su reborde y centro coloread con zona anular  pálida, parecido a leptocitos (talasemias, hepatopatias, a.ferropenicas intensas; a veces cuando solo aparecen en algunas zonas de extensión, to tiene significado clínico, es simplemente un artefacto /producto de manipulación errónea)

3-Drepanocitosis: en forma de hoz o hematíes falciformes o drepanocitos (anemia de células falciformes - contienen Hb anomala / Hb S)

4-Eliptocitosis: forma elíptica/eliptocitos) u oval/ ovalocitos); es normal encontrarlos en condición normal en 1% aproximadamente. (en anemias ferropenicas - hasta un 10%, anemias megaloblástica y mielo fibrosis – trastornos de medula osea; típica de eliptocitosis hereditaria - hasta 25-90 %)

5-Equinocitosis: forma espículas cortas/equinocitos o hematíes crenados/arrugados y distribuidos regularmente a lo largo de toda su superficie (uremia, hematíes pobres en K+ y hepatopatias neonatales y también en sangre conservada y como artefactos de una extensión debido a contracción de los hematíes en un medio hipertonica - se deshidratan)

6-Esferocitosis: forma esférica/esferocitos habitualmente también de pequeño tamaño/microesferocitos; alto contenido de Hb (hidrocitosis – hematíes sobre hidratados, anemias hemolíticas autoinmunes y esferocitosis hereditaria).

7-Esquistocitosis: fragmentados/esquistocitos; son muy pequeños 2-3u que se forman por extrangulacion de filamentos de fibrina o por fragmentacion mecánica (a.hemolítica microangiopatía en la hemólisis mecánica - por la prótesis valvular en el corazón y quemaduras graves)

8-Estomatocitosis: invaginación central en forma de boca/estomatocitos en forma discos uniconcavos (alcoholismo, hepatopatias crónicas y estomatocitosis hereditaria)

9-Excentrocitosis: hematíes cuya Hb esta concentrada en uno de sus polos/excentrocitos (anemia de déficit de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa)

10-Keratocitosis / hematies en forma de sombrero de polichinela / hematies en casco: dos espículas en su superficie/keratocitos (anemia hemolítica microangiopatía-hemólisis por prótesis cardiacas y en hemangioma cavernoso–tumor benigno de los vasos sanguíneos)

11-Poiquilocitosis: una sola prolongación alargada en forma de una raqueta de tenis/poiquilocitos o de una lagrima/dacriocitos en talasemias y en las anemias severas.

Alteraciones del color – hematíes normo crómicos con la tinción habitual, presenta un color rosada (eosinofila), es mas intensa en la periferia que en el centro. Por lo tanto, la coloración del hematíe depende de la cantidad de Hb contenida en ellos.

1-Anisocromia: falta de uniformidad en la coloración entre unos hematíes y otros; es una alteración importante que refleja un trastorno profundo de la eritropoyesis (tratamiento de las anemias carenciales, anemia hipocroma que son transfundidos)

2-Hipocromia: color pálido en el centro y cambio brusco en la periferia/ hipocromicos u anulocitos / celulas Donut (a.ferropenicas)

3-Hipercromia: intensamente coloreados/híper crómicos (esferocitosis hereditaria)

4-Policromasia / Policromatofilia: una coloración ligeramente basofila/ azulada que realmente son reticulocitos)

Inclusiones intraeritrocitarias – los hematíes normales solo contienen Hb y homogéneo; Hay que diferenciar entre los que se tiñen con panóptica y los que se tiñen con una tinción vital o citoquimica.

1-Sustancia granulo filamentosa o reticulofilamentosa: procede de restos ribosómicos agregados, visible con tinción vital de azul de cresil brillante (realmente son reticulocitos)

2-Cuerpos de Heinz: precipitados de Hb, pequeñas granulaciones en la periferia, visible de color púrpura con tinción cristal violeta/ panóptico (enfermedades congénitas /defecto congénito de Hb o déficit congénita de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, inestabilidad de Hb y por medicamentos sulfamidas, antipalúdicos, antipiréticos, analgésicos, habas etc. que causa precipitación de la Hb oxidada) y también en las anemias de déficit de glucosa 6 fosfatos deshidrogenasa)

3-Cuerpo de Howell-Jolly: pequeño residuo nuclear único +/- 1u, adosados a su membrana, un grumo visible de color entre rojo oscuro y negro (pacientes esplenectomizados y enfermedad sprue/celiaca/ mal absorción)

4-Cuerpos de Pappenheimer o gránulos sideroticos: acúmulos de hemosiderina unida a proteínas que están en tal cantidad que pueden ser visibles en los hematíes y en  los reticulocitos; gránulos basófilos con las tinciones habituales, y se tiñen de una llamativa color verde con la tinción de Perls/azul de Prusia (esplenectomizados, en cualquier caso de sobrecarga ferica y anemias sideroacresticas)

5-Punteado basófilo (Hb H)/ mórula: agregados ribosómicos por degeneración vacuolar del citoplasma o precipitados de cadenas globinicas libres; puntitos basófilos, tamaño variable y dispersos por toda la superficie del hematíe, no se tiñen con la tinción de Perls (intoxicaciones por plomo/ saturnismo, talasemias alfa y leucemias)

6-Anillos de Cabot: restos de la membrana nuclear o de microtúbulos debido a mitosis anormal, hilos basófilos en forma de anillo o de ocho y pueden ocupar toda la periferia celular (algunos trastornos de eritropoyesis, a.megaloblástica).

7-Inclusiones parasitarias: hematíe parasitado por un trofozoito en forma anular/anillo palúdico; en babesiosis / plasmodium dan aspecto de anillo o de pera en el interior de los hematíes.

8-Vacuolas: A veces los hematíes pueden parecer que están vacuolados, esto no tiene importancia; es un artefacto de una tinción.

9-Núcleos; pueden aparecer en ciertas patológicas, e.j. anemias importantes, leucemias, son normoblastos ortocromatico; aunque puede haber formas mas jóvenes en caso de anemias muy graves y también en pacientes esplenectomizados.

GENERALIDADES SOBRE LAS ANEMIAS

Anemia – disminución de la concentración de Hb en sangre periférica (acompañado siempre por - HCT y en general - RBC) que origina hipoxia histica (el déficit en la oxigenación de los tejidos); valores inferiores a:

-en niños de 6 meses a 6 años 11 g/ 100 ml (12 g/dl +/- 2)

-en niños de 6 años a 14 años y en mujeres adultas 12 g/ 100 ml (14 g/dl +/- 2)

-en varones adultos 14 g/ 100 ml (16 g/dl +/- 2)

Falsas anemias en el embarazo (hemodilucion), al contrario de una hemorragia aguda importante.

Manifestaciones clínicas: (causado por mecanismos de adaptación para paliar déficit de O2 de los tejidos (hipoxia hística)

-Intraeritrocitarios: disminución de la afinidad Hb por el oxigeno por el aumento de 2,3 bifosfoglicerato.

-Extraeritrocitarios: estimulo de eritropoyesis (+secreción de EPO por falta de oxidación de los tejidos), redistribución sanguínea/palidez de la piel (responsable de taquicardia, soplo sistólico, palidez por vaso-constricción apreciable en la conjuntiva de los ojos y dilatación cardíaca), debilidad, astenia, fatiga fácil, amenorrea/ ausencia de menstruación, intoleracion al frió, perdida de concentración, alergia, dolor de cabeza, perdida del deseo sexual, en crisis aguda puede producir: mareo; lipotimias y uremia (insuficiencia renal).

Clasificación – según distintos criterios:

-según el origen: anemias centrales (MO), anemias periféricas (sangre periférica)

-según la afectación de la eritropoyesis/ afectación de MO: anemias arregenerativas (alteración cualitativa o cuantitativa de los eritroblastos en MO y descenso de reticulocitos en la sangre periférica); anemias regenerativas (incremento eritroblastos y ascenso de reticulocitos).

-según Hb de los eritrocitos: anemias hipocromas (HCM<27pg), anemias normocromas (HCM normal), anemias hipercromas (HCM > 31 pg)

-según el tamaño de los eritrocitos: anemias microciticas (macrocitosis <7u y <80u3), anemias normociticas (normocitosis) y anemias macrocítica (macrocitosis >8u y >100u3)

Para el diagnostico de anemia y la causa que la produce, es básico el estudio clínico del paciente ya que la anemia no es una enfermedad en si misma. Es un síntoma de una enfermedad. Hay que hacer un perfil hematologico básico que hay que incluir un recuento celular, Hb, HCT e indices, reticulocitos, VSG y estudio de frotis.

ANEMIAS MICROCITICAS

1-Anemia ferropénica – el déficit del Fe es la causa mas común de las anemias llegando a padecerla millones de personas en el mundo; carencia de hierro que afecta la formación de Hb, formación de mioglobina muscular y enzimas celulares: por falta de aporte (déficit nutricional) y disminución de la absorción (gastrectomía, síndromes de mal absorción), aumento de las necesidades (adolescencia, embarazo), incremento de las perdidas (hemorragias digestivas y genitales);

Manifestaciones clínicas: síndrome de Plummer-Vinson (trastorno de formación de mioglobina muscular y algunas enzimas celulares - aparte de alteración en formación Hb), incremento de la fatigabilidad, glositis con dificultad en la deglución, rágades/baqueros (heridas en los labios), re-secamiento de la piel, la caída del cabello, uñas frágiles, secas y planas (en vidrio de reloj);

Datos de laboratorio – en la sangre periférica: hematíes pequeños VCM bajo (microcitosis), pálidos/hipocromía, con aspecto de anillo/anulocitos, HCM y CHCM son bajas; disminución de reticulocitos (por no poder formar eritroblastos), hierro sérico bajo, CTFH alta y cuando la sideremia baja, también % de saturación de transferrina baja, ferritina sérica baja, descenso de bilirrubina sérica (por < Hb, < degradación, el color de suero mas claro); la concentración de transferrina alta, cuando hay menos Fe (manera compensatoria).

Datos de laboratorio – en la MO: discreta hiperplasia eritroblástica, eritroblastos anómalos (pequeños con un reborde citoplásmico desflecado - normoblastos de papel), con tinción Perls se observa ausencia de hierro en las células reticulares y ausencia de sideroblastos.

Tratamiento - hierro bivalente por vía oral +/- 3 meses.

2-Anemias de las afecciones crónicas – se origina en las patologías: infecciones bacterianas y fúngicas, inflamación prolongada, colagenosis (lupus eritematoso), nefropatías, hepatopatias, carcinomas, linfomas; mecanismo de producción: 
-baja formación de los eritrocitos por secuestro del hierro en el SER;
-cierto grado de hemólisis generado por: esplenomegalia en infecciones, eritrociticas anómalas en las hepatopatias crónicas, toxinas hemolíticas (producida por clostridium), metabolitos hemolíticos que se acumulan en la insuficiencia renal;
-una insuficiente de elevación de la eritropoyetina en relación al grado de anemia;
-el aumento inflamatorio de la ferritina (reactante de fase aguda, aumentada en inflamación)

Datos de laboratorio – en la sangre periférica: ligera microcitosis e hipocromia o norm ocitosis y normocromia (al principio); discreto descenso de reticulocitos; disminución del hierro serico y CTFH (porque no hay aumento de transferrinemia compensatoria sino que esta disminuida); la ferritina sérica alta; pequeño ascenso de bilirrubina.

Datos de laboratorio – en la MO: eritropoyesis normal, algo incrementada; con tinción de Perls se observa un secuestro de hierro en forma de grumos en el SER (hay hemosiderina), disminución o ausencia de sideroblastos.

Tratamiento – es de la afección causal.

3-Anemias sideroacrésticas/sideroblásticas – utilización defectuosa del hierro y trastorno en la síntesis del HEM; pueden ser congénitas mediante una transmisión ligada al sexo (cromosoma X) o adquiridas: idiopáticas (primaria/esencial) o secundarias (actualmente se piensan que son por leucemias (alteración de MO) p.e. intoxicación crónica por plomo (saturnismo) y déficit de piridoxina (vitamina B6), alcoholismo y sustancias que inhiben la síntesis mitocondrial de la protoporfirina (las mitocondrias de eritrocitos no pueden sintetizar la protoporfirina IX y el Fe que ha penetrado no tiene molécula donde unirse para formar HEM, y se deposita en las mitocondrias dañando las y provocando la lisis de muchos eritroblastos y los que logran madurar serán hematíes hipocromicos).

Datos de laboratorio – en la sangre periférica: anisocitosis, anisocromia, microcítica e hipocromica o normocromica y normocitica (doble población), cuerpos de Pappenheimer, reticulocitos disminuido,  hierro sérico normal o aumentado, CTFH normal o disminuida,  ferritina sérica aumentada, % de saturación de la transferrina estará normal o aumentada en función como esta el Fe.

Datos de laboratorio – en la MO: hiperplasia eritroblástica, con tinción de Perls se observa sobrecarga de hierro en SRE, exceso de sideroblastos (eritroblastos con gránulos de hemosiderina/oxido de hierro esparcidos en su citoplasma /sieroblastos en anillo).

Tratamiento: el de la afección de base

4-Hemoglobinopatias – alteraciones de la globina por mutación es genéticas que condicionan una variación en la estructura de la cadena (hemoglobinopatías estructurales) y una disminución en la síntesis de la misma (talasemias); son anemias hemolíticas.

4.1. Hemoglobinopatías estructurales (hereditarias): 95% de casos son sustitución de un aa en una de las cadenas polipeptídicas de Hb da lugar a hemoglobinas anormales en cuanto a afinidad por el oxigeno, inestabilidad, etc (>250 variantes afectan cadena alfa y >350 afectan cadena beta; la mayoría sin sintomatología clínica:

a-Hb S: sustitución de aa glutámico por una valina en la posición 6 de la cadena beta;  en pacientes homocigóticos acarrea/causa deformación de los hematíes en forma de hoz (drepanocitos), favorecido en situaciones de disminución pH e hipoxia ya que la HbS cuando esta oxigenada es normal; este tipo de anemia (hemolítica) se llama a.de células falciformes / a.drepanocitica; los drepanocitos debido a su forma son mas fácilmente destruibles ==> cuadro hemolítico y aumentan viscosidad de sangre ==> tromboembolicos, infartos múltiples y dolorosos en diversos órganos; electroforesis - manifiesta la banda de HbS entre 50-80%; frecuente en Africa (raza negra); en pacientes heterocigoticos no hay sintomatologia; tratamiento - evitar infecciones, prevenir hipoxia, evitar formación de los drepanocitos (analgésicos, hidratacion y oxigeno).

b-Hb con funciones anormales: mayor afinidad por el O2 (Hb Hiroshima), menor afinidad por el O2 (Hb Kansas) y Hb en forma de matahemoglobina (Hb Boston); Hb Hiroshima provoca hipoxia tisular y Hb Kansas - Hb Boston provoca cianosis; se pueden detectar mediante electroforesis.
c.Hb inestables: la sustitución del aa afecta a la zona de contacto entre las cadenas alfa y beta o la bolsa de Hb ==> defecto en el enlace de Hb, aparición de cuerpos de Heinz (tetramero de globina intracelular) únicos y excéntrica que modifican la elasticidad de hematíe ==> hemolisis; diagnostico - a. hemolítica con reticulocitos aumentados, hiperbilirrubinemia y descenso de haptoglobina (proteína que transporta Hb desde la sangre hacia SRE para su almacenaje, así evitar su eliminación por la orina); prueba - biología molecular, resistencia al calor,etc; tratamiento - evitar los fármacos oxidantes.

4.2.Talasemias - grupo heterogéneo de enfermedades hereditarias originadas por defecto de síntesis parcial o total de una o mas de las cadenas polipeptídicas de la globina que forman la hemoglobina. La secuencia de aa es normal, por lo que se considera a las talasemias defectos cuantitativo;
thalassa (mar) ==> frecuente entre habitantes de la cuenca mediterránea y trastorno genético mas frecuente en el mundo; 2 criterios para clasificar:
- Clínico, según la gravedad la talasemia sera mayor (homocigótico) o menor (heterocigótico)
- Genético-bioquímico, depende de la cadena que se deja de sintetizar sera talasemias alfa o talasemias beta/delta-beta (también las hay delta o gamma);
La síntesis defectuosa de la cadena de globina ==> a.microcítica hipocroma, forman tetrámeros de Hb inadecuados ==> produce menos Hb A (alfa2beta2) y exceso de cadenas no apareadas ==> precipitan en el eritroblastos;  intramedularmente ==> eritropoyesis ineficaz;  extramedularmente ==> hemólisis.

a.Talasemias alfa:  disminución de la síntesis de cadenas alfa (implica tener un exceso de cadenas beta y se forman tetrámeros de cadenas beta4, llamada Hb H), frecuente en individuos de color y los asiáticos y muy rara en España; t.a.menor ==> no presenta síntomas clínicos ni hematólogicos, se necesita un estudio de ADN para diagnosticar, porque no se detecta por electroforesis; t.a.intermedias ==> a. microcítica hipocroma de intensidad variable con Hb H visualizado al teñir con azul de cresil brillante como un punteado basófilo en forma de mórula y se detecta por electroforesis; t.a.mayor/hidropesía fetal ==> ausencia total de cadena alfa, se forma Hb Bart (gamma2 beta2) en lugar de HbA, incapaz de transportar O2 (en todas las Hb normales hay cadena alfa).

b.Talasemias beta: disminución de la síntesis de cadenas beta, frecuentes en nuestro entorno; t.b.menor ==> portadores heterocigóticos, son asintomáticos o presentan anemia leve microcítica hipocroma (pseudopoliglubulia microcítica, RBC normal, Hb baja), se agrava con infecciones o embarazo; electroforesis ==> HbA2 (alfa2 delta2) elevada >4%, compensa la menor producción de cadena beta; t.b.mayor ==> homocigóticos (a.de Cooley), forma muy grave donde se acumula cadenas alfa y provoca eritropoyesis ineficaz y hemólisis, presenta a. microcítica con punteado basófilo y dianocitos; electroforesis ==> HbA2 (alfa2 delta2) y HbF (alfa2 gamma2) elevadas; el exceso de Fe originado por múltiples transfusiones ==> hemosiderosis progresiva que provoca la muerte; tratamiento ==> transplante de MO.

Datos de laboratorio en las talasemias – microcitosis e hipocromía, hematíes con punteado basófilo, anisocitosis, dianocitos, poiquilocitos, etc; talasemia beta menor ==> pseudopoliglubulia microcítica (aumento RBC, VCM disminuido y RDW disminuido); disminución de HCT y Hb; aumento moderado de reticulocitos; Hierro sérico aumentado y CTFH disminuida; Ferritinemia normal o aumentada, Bilirrubina sérica aumentada; aumento de eritroblastos en sangre periférica en formas mas graves; maduración anómala de eritroblastos (diseritropoyesis) y aumento de los eritroblastos  sideroblastos; las anomalías hemoglobínicas detectadas por electroforesis de Hb ==> Hb H /beta4 y Hb Bart (gama2 beta2 migran mas rápidamente que la HbA.


Tratamiento - transfusiones y transplante de MO en anemias mayor o intermedias; t.beta menor ==> vigilancia sin tratamiento (excepto cuando Hb este por debajo de 10 gr/dl o existan manifestaciones clínicas); en situaciones de embarazo, crecimiento ==> preparados con ácido fólico + vit.B.7.

ANEMIAS NORMOCITICAS

1.Insuficiencias Medulares - engloba varios procesos patológicos en los que esta afectada la producción de células sanguíneas por parte de la MO.
a.Anemia aplasica o pancitopenia
Etiopatogenia (porque y como se produce el desarrollo de la enfermedad): se debe a la destrucción de las células madres pluripotentes conlleva una disminución en la producción de hematíes, leucocitos y plaquetas, excepto en el caso de la "aplasia pura de células rojas" (solo disminución de la serie roja);  causas: congénita; adquiridas (inducidas por radiaciones ionizantes, toxicas: por derivados del benceno, medicamentosas: como antibióticos y anti-inflamatorios, infecciosas: virus hepatitis E, auto-inmunes); idiopaticas >50% de los casos.
Manifestaciones clínicas: síntomas y signos de anemia, el paciente sufren anemia aplasica, mayor tendencia al padecimiento de infecciones (hay menos leucocitos) y hemorragias, astenia, debilidad, etc.

Datos de laboratorio - en la sangre periférica: a.normocromica  normocitica o ligeramente macrocitica; el recuento de reticulocitos bajo (reticulopenia); el recuento de granulocitos es inferior a 500/mm3 y el plaquetas es inferior a 20.000/mm3; hierro serico elevado y CTFH normal.
- en la MO: descenso de la celularidad, con sustitución del ejido hematopoyetico por tejido graso.
Tratamiento: el pronostico es pesimista y el tratamiento es de mantenimiento; supresión de posible agente etiologico como primer objetivo; androgenos, transfusiones, transplante de MO.

b.Anemia Mielotisica - se debe a una infiltración de la MO por: procesos neoplásicos (leucemias y metástasis de carcinomas de mama, de pulmón de estomago, etc), tuberculosis de los órganos hematopoyeticos, depósitos de sustancias, fibrosis.

c.Anemia dismielopoyeticas refractarias o síndromes mielodisplasicos - una maduración alterada de las tres clases celulares de la MO que conlleva una insuficiencia medular; generalmente en ancianos y puede surgir tras un tratamiento con algunos quimioterapicos.

d. Aplasias eritrocitarias puras - trastorno aislado en la formación de eritrocitos, la mayoría de los casos idiopaticas o de carácter auto inmune.

2.Anemias Hemolíticas - etiopatogenia: Vida media de los hematíes 120 días - 250 km (gracias a la elasticidad de su membrana y contenido enzimático); cada día 1% fagocitado/destruido por SRE (bazo, hígado y MO) y MO produce la misma cantidad (homeostasis); en una hemolisis alta, MO hace un esfuerzo superior para compensar, sino, se produce anemia hemolítica.
Clasificación - intracorpusculares: defecto de la membrana (membranopatias), de los enzimas (enzimopatias) o de la Hb (Hb inopatias); son hereditario o adquirido; hemolisis extra-vascular (SRE)
- extra-corpusculares: presencia de Acs antieritrocitarios, parásitos, sustancias toxicas, fármacos; son adquiridas; hemolisis intra o extra-vascular.

Anemias Hemolticas Intracorpusculares (AHI)
a. AHI Membranopatias:
- Esferocitosis Hereditaria (enfermedad de Minkowski-Chauffard); autosomica dominante, frecuente en europea; disminución en la fosforilizacion proteínas espectrina y anquirina ==> adoptan forma esférica, rígido/ inflexible y fácilmente destruidos por el bazo; la hemolisis crónica provoca anemia moderada desde la edad infantil, ictericia y espenomegalia.
Datos de laboratorio - hematíes redondos e hipercromicos en el frotis y reticulocitosis; prueba de fragilidad osmótica es positiva.
Tratamiento - esplenectomia después de los 6 anyos (un órgano importante en la defensa de las infecciones); el defecto no se corrige, pero alarga la vida del hematíe.
- Eliptocitosis Hereditaria: anomalía en la proteína espectrina que adopta forma elíptica; menos incidencia que esferocitosis y pacientes no presentan clínica ==> no necesitan tratamiento.
- Hemoglobinuria Paroxistica Nocturna HPV (enfermedad de Marchiafava-Miceli); defecto adquirido en la ausencia del factor acelerador de envejecimiento (proteína fijadora C8) ==> sensibilidad especial al complemento ==> crisis hemolíticas nocturnas y desencadenadas por infecciones, ingestión del hierro, menstruación; 50% de los casos a la manyana siguiente ==> emisión de orina roja (hemoglobinuria macroscopica); el hallazgo de células epiteliales con hemosiderina en el sedimento de orina; granulocitopenia, trombocitopenia y tromboticos; re-generativo de MO ==> reticulopenia; otro 50% de casos ==> cuadro clínico hemolítico mas larvado/ocultado con leucopenia y/o plaquetopenia y reticulopenia; en lab ==> los eritrocitos se muestran mas sensibles al calor, al medio ácido y a la sacarosa; frecuente en adultos jóvenes y paliada mediante transfusiones.

b.AHI Enzimatopatias:
el déficit de las enzimas que intervienen en la glucolisis (degradación de la glucosa) intraeritrocitaria anaerobica o aerobica ==> carencia de energía suficiente en forma de ATP ==> no puede mantener la forma discodea del Hematíe, Fe en estado ferroso y Hb en estado funcional.
- Déficit de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G-6-PD): trastorno hereditario, ligado al sexo (cromosoma X); se desencadena tras unas horas o escasos días de la ingestión de sustancias oxidantes en medicamentos (analgésicos, sulfamidas) y alimentos (habas/favismo) ==> acumulo de peróxido de hidrógeno en el hematíe ==> oxidación de Hb (precipitación Hb ==> cuerpos de Heinz) y peroxidacion de los lipidos de la membrana (alterada) ==> hemolisis; la crisis hemolítica cursa con fiebre, ictericia, anemia normocitica-normocromica, reticulocitosis, cefaleas, etc.
- Déficit de piruvato-quinasa (PK): se transmite de forma recesiva autosomica (portador) y solo los homocigóticos tiene manifestaciones clínicas.

c.AHI Hemoglobinopatias: (mirar anemias microciticas)

Anemias Hemoliticas Extracorpusculares (AHE)
a.AHE Auto inmunes: por la acción de Acs (idiopaticas) que se adhieren a la membrana de los hematíes (forman aglutinados de glóbulos rojos ==> retenidos/hemolizados por SRE) acortando su vida media; si Acs se combina con el complemento ==> hemolisis directa; algunos Acs acompañan a colagenosis (lupus eritema-toso diseminado) y a enfermedades malignas proliferativas del sistema linfocitico o reticuloendotelial (leucemia linfocitica crónica y reticulosarcoma).

b.AHE toxicas, infecciosas y mecanicas: por la accion de sustancias toxicas (plomo, benzol), por la accion de microorganismos (plasmodium penetrado directamente dentro de los hematíes o estreptococo hemolítico atraves de sustancias hemolisinas que sintetizan), por un efecto mecánico (válvula cardiaca artificial)

Manifestaciones clínicas de las anemias hemolíticas - ademas del cuadro clínico de anemia:
- esplenomegalia por aumento de la función destructiva del bazo
- ictericia por hiperbilirrubinemia
- trastornos del crecimiento y deformaciones esqueléticas, por hiperplasia medular compensatoria
- en la esferocitosis hereditaria, son muy frecuentes los cálculos biliares.

ANEMIAS MACROCITICAS

A.Macrociticas – se caracterizan por tener sus hematíes un VCM > 100u3 siendo 95% de ellas megaloblasticas; principal etiopatogenio es el fallo de sintesis ADN (ácidos nucleicos) debido a deficit de vitamina B12 (cobalamina) y/o de ácido folico ==> perturba la división celulares que se renuevan rápidamente (las intestinales y el tejido hematopoyetico ==> defecto en la formación de los eritrocitos y otras células sanguíneas; leucocitos resultan grandes también); 5% restantes no son megaloblasticas (producidas por alcoholismo, hepatopatias crónicas, neoplasias, etc).

A.Megaloblástica - son anemias centrales, arregenerativas y la mielopoyesis caracterizada por una maduracion nuclear y citoplasmatica asincronica en todas las estirpas celulares (mieloide y eritroide y se les llama asi para describir los precursores normales eritroides que aparecen en la MO de los pacientes; las a.megaloblasticas se deben a una carencia de vit.B12 (cobalamina) o ácido folico;


  

Déficit de vit. B12 - abunda en alimentos de procedencia animal (carnes y lácteos), no existe en los vegetales; función de vit.B12 ==> participan en el metabolismo de los folatos y degradación ácidos grasos; necesita glucoproteina secretado por la mucosa gástrica (FI de Castle) para atravesar la pared del íleon; ==> sangre (transportada por proteína transcobalamina 1&2) ==> MO (órganos de utilización) o hígado (deposito 3/5 anyos); necesidades diarias de vB12 = 1 ug y su reserva hepática 1.000-2.000 ug; los motivos de su carencia: congénita – ausencia de actividad del FI (los ninyos padecen la anemia en 1er/2nd anyo de vida cuando ya han consumido todo la vit.B12 de la madre), absorción dificultosa del complejo vB12-factor intrínseco y déficit de transcobalamina;  adquiridas – aporte insuficiente (vegetarianos estrictos), robo intestinal por parásitos (tenia) o bacterias consumidoras de vB12 (asa ciega en el intestino), escasa producción de FI (Acs contra el FI, gastritis atrófica o gastrectomizados) y síndrome de mal-absorción; Las a.megaloblasticas causado por déficit de FI ==> a.perniciosas o a.de Addison Biermer.

Déficit de acido fólico – folia (hoja), abunda en vegetales (espárragos/ brecol/ lechuga/ espinacas/ judías-verdes) y en el hígado (se inactiva con el calor ==> hervidos/ enlatados), necesidades diarias 25-50 ug, se absorbe por el yeyuno y se almacena en el hígado y también en el rinyon (3/4 meses); en la sangre ==> transportado por albumina hacia los órganos de utilización;  los motivos de su carencia: aporte insuficiente, necesidades aumentadas en el crecimiento y embarazo, síndrome de malabsorcion, alcohólicos crónicos y ingesta de sustancias antagonistas (fármacos citostaticos, anti-convulsivantes/difenilhidantoina y toxoplasma /pirimetamina), aumento de demanda hematopoyeticas.

Manifestaciones clínicas: síntomas y signos propios de la anemia, alteraciones del sistema nerviosos (neuropatías, trastornos psiquiátricos) y alteraciones de las mucosas (glositis).

Datos de laboratorio –  en la sangre periférica:  megalocitos con forma ovalada o elíptica; macrocitosis e hipercromia relativa (CHCM normal ==> proporción entre cantidad Hb y el volumen de hematíe), también coexisten macrocitosis ==> anisocitosis; poiquilocitosis y policromasia por inmadurez de los megalocitos; reticulopenia, trombocitopenia y leucocitopenia ==> menos cantidad (los neutrófilos son anormalmente grandes e híper segmentados >/= 5 lóbulos); hierro serico y bilirrubina serica ligeramente aumentados por hemólisis; VN vit.B12 > 150 pg/ml  VN ácido fólico 3mg/ml.
Determinaciones ==> ensayos biológicos sobre bacterias o radio ensayos con isótopos del cobalto puede diferenciar entre las carencias de vit B12 (su concentración en el suero) y las de acido fólico (en el suero y en los hematíes).
Un test de Schilling puede diferencia una anemia megaloblástica por déficit de vB12 o de FI: saturar el organismo con vit B12 1.000 gammas (ug) de cobalamina (inyección intramuscular) así saturamos el transportador (transcobalamina)  2 horas después v B12 por vía oral marcada con 58Co  posteriormente si no se detecta la radioactividad urinaria, se confirmara la existencia de un trastorno en la absorción oral de la vitamina B12; después de 2 horas se administra vía oral Vita B12 marcada con un isótopo radiactivo del cobalto y ligada a FI  si no se detecta la radioactividad urinaria, se confirmara la existencia de un déficit de B12 por absorción dificultosa del complejo vitamina B12-FI.

Datos de laboratorio – en la MO: hiperplasia con numerosos megaloblastos de gran volumen, basofilia, con cariorrexis (desintegración nuclear) y frecuentemente en mitosis; las células de granulopoyesis son grandes y sus núcleos son excesivamente lobulados; con la tinción Perls se observa presencia abundante de hierro en las células del SER (por hemolisis?).


Tratamiento: administración de vit B12 o de acido fólico por la vía apropiada.


A.Perniciosa (a.megaloblastica por déficit del factor intrínseca de Castle) - pueden ser congenitas o adquiridas; e.j. gastritis de larga duración que conduce a una atrofia de las celulas secretoras del FI; tambien por alteracion inmunologicas contra FI aunque muchas veces sera de origen desconocido;
datos de laboratorio y tratamiento son iguales que a.megaloblastica.

POLICITEMIAS Y POLIGLOBULIAS

Policitemia – aumento de la masa eritrocitaria, leucocitaria y trombocitaria; Poliglobulia o eritrocitosis – incrementa la masa eritrocitaria.

1.Poliglobulia relativa o pseudopoliglobulia – HCT / hemo-concentración alto (volumen plasmático disminuido), reticulocitos, plaquetas y WBC normal - en MO también normal; por la ingesta de diuréticos o deshidratación (quemaduras graves y diarrea); también puede generarla el estrés (síndrome de Gaisbock) y consumo abusivo de alcohol.

2.Poliglobulias secundarias – incremento de HCT por consecuencia de otras patologías: hipoxemia exógenas de las grandes alturas - falta O2 en la atmosfera, hipoxemias endógenas por EPOC (enfisema pulmonar, bronquitis crónica); metahemoglobinemia; inhalación humo de tabaco/incremento de CO2; alteraciones hormonales del cortisol en el síndrome de Cushing o de la testosterona en tumores masculinizantes; hipernefroma (híper producción de eritropoyetina) y hemoglobinopatias (Hb tienen una elevada afinidad por el O2); hipoxemias y hemoglobinopatias por elevada afinida de Hb por el O2 ==> hipoxia tisular ==> la secreción de EPO.

3.Policitemia vera (PV) o policitemia esencial o enfermedad de Vazquez – dentro de la clasificación de síndromes mieloproliferativos (junto con la mielofibrosis, leucemia mieloide crónica y trombocitemia primaria); hiperactividad e la MO que afecta las 3 series celulares y predomina hiper-función eritropoyetina sin aumento sericos de EPO; MO podría tener una hiper-respuesta medular; frecuente en los varones entre los 50-60 anyos y los judíos; suele evolucionar hacia leucemia aguda; en 15% de pacientes suele evolucionar en un proceso agudo, otro 15% suele evolucionar hacia una metaplasia mieloide (proliferacion exagerada en MO de fibroblastos, osteoblastos) con focos de metaplasia también en baso, hígado, MO y ganglios linfociticos ==> conduce a hemorragia interna.

Manifestaciones clínicas: síntomas anodinos/no significante (debilidad, mareos, disnea, cefaleas), cursa con: coloración rojiza de la piel/la cara (eritrosis); aumento HCT, hiperviscosidad sanguínea  trombosis arteriales; hemorragias por anomalía en la función de las plaquetas; hepatomegalia y  esplenomegalia (por hiper-función); hiperuricemia ==> gota y cálculos renales; ensanchamiento de la cavidad medular que causa dolores óseos; es frecuente la hiper tensión arterial en 40% de los pacientes y prurito tras el banyo, probablemente por la liberación de histamina por los basofilos que estan aumentados.

Datos de laboratorio – en la sangre periférica: volemia aumentada ligeramente, pero lo que caracterizan el aumento de la masa eritrocitaria que sera microcitica y hipocroma secundaria (?) a un déficit de Fe por la hiper producción; concentración de Hb > 18g/dl en varones y > 16 g/dl en las mujeres;  HCT > 54% en los varones y > 50% en las mujeres; RBC > 6 millones en los varones y > 5,6 millones en las mujeres;  múltiples anomalías en la forma y tamaño de los hematíes (en las fases avanzadas de la enfermedad);  leucocitosis con desviación a la izquierda (jóvenes);  FAL (fosfatasa alcalina leucocitaria/ enzimas de los neutrofilos) elevada;  precursores inmaduros de los eritrocitos y leucocitos;  trombocitosis - pero no funcionan bien (hay hemorragia);  (?)vit B12 serico incrementado; (?)hiperuricemia e (?)hiperuricosuria (ácido úrico); la saturacion de O2 normal, sirve para diagnostico diferencia con las poliglobulias secundarias a la hipoxia de los broncopatas (EPOC).

Datos de laboratorio – en la MO: la MO es hipercelular y pobre en grasa; el Fe disminuido.

Diagnostico mayores: 
-aumento de la masa eritrocitaria (medida con 51Cr) >36 ml/kg de peso corporal en varones y > 32 ml/kg en mujeres; 
-incremento de la saturación arterial de oxigeno (SaO2) > 92%; 
-esplenomegalia.

Diagnósticos menores: 
-trombocitosis > 400.000 plaquetas por mm3;
-leucocitos > 12.000 por mm3 (sin que haya infecciones);
-ascenso de la fosfatasa alcalina leucocitaria > 100 UI (sin infección) y > B12 serico > 900 ng/ml.

Diagnostico PV se establece con la concurrencia de 3 criterios mayores o 2 primeros criterios mayores y 2 criterios menores.

Tratamiento: sangrías/donar sangre (flebotomía) - no perjudica al receptor de la sangre? y míelo supresores (p.e. 32P e hidroxiurea).

4.Eritroleucemia o síndrome de Di Guglielmo – proliferación excesiva de la serie eritroide, anormalidades en los eritroblastos y híper producción granulocitica (de menor cuantia);  su cuadro clínico es el propio de una leucemia.

Velocidad de Sedimentación Globular - VSG

Concepto - consiste en determinar la velocidad en que se sedimentan los hematíes al colocar la sangre en una columna durante una unidad de tiempo generalmente 1 hora.  Los hematíes poseen carga electrostática (-) en su membrana que provoca fenómenos de repulsión entre ellos y los mantienen suspendidos sin aglomerarse. En condición normales, si se coloca la sangre en un tubo en posición vertical, las células debido a la fuerza de la gravedad tienden a depositarse en el fondo. Si la carga electrostática disminuye por la causa que sea, los hematíes tienden a aglomerarse aumentando la velocidad de sedimentacion. VSG se expresa como los milímetros que las células han descendido, durante un periodo de tiempo (1 hora), antes también se hace en 2 horas.

Fases - (1) periodo inicial de agregación y durante esta fase se forman apilamientos y la VSG relativamente lenta y dura +/- 10 minutos (no hay cambios?)
(2) periodo de sedimentación rápida; durante este periodo la velocidad es estable y dura +/- 45 minutos.
(3) periodo final de concentración; dura el resto de tiempo.

Factores - VSG depende fundamentalmente de las proteínas de plasma y algo menos de los elementos formes; todo elemento de las globulinas o fibrinogeno plasmáticos, acelera la VSG, lo que ocurre en la mayoría de las infecciones.
(1) factores físicos/fisiológicos (mayor o menor tendencia de los hematíes que forman agregados) - mas alta en mujer, vejez y embarazo.
(2) factores químicos; la gran influencia que tienen las proteínas plasmáticas; niveles alto de fibrinógeno provocan una disminución de la carga electrostática de los eritrocitos.
(3) factores biológicos; destacan el embarazo y menstruación
(4) factores plasmáticos; los niveles elevados de fibrinógeneo y en menor medida de las globulinas favorecen la aceleración de VSG; estas proteínas actúan disminuyendo la carga electrostática de los hematíes lo que favorece la formación de apilamiento.
(5) factores eritrocitarios: a. la carga eléctrica y el numero de eritrocitos - VSG es inversamente proporcional al numero de hematíes; b. tamanyo celular - los macrocitos caen mas rápidamente que los microcitos; c. la forma - VSG disminuye porque los hematíes anómalos no se pueden apilar normal.
(6) factores ajenos - anti-coagulante que se usan; si existe o no hemolisis; por la inclinación de tubo; burbujas de aire; temperatura; tiempo de VSG.

Métodos - manual estandarizado (westergren)
Material - pipetas de westergren +/- 1 ml y esta graduada de 0-200 mm, gradilla o soporte de westergren, tubos mezclados de VSG que llevan anti coagulante incorporado (citrato sódico 3,7%) en que la proporción es 1 parte de citrato y 4 de sangre; reloj avisador y la sangre total;
Técnica - extracción de sangre, vertemos al tubo hasta la senyal, mezclamos, introducimos la pipeta dentro del tubo en la gradilla, en un lugar en posición vertical durante 1 hora;
Resultad - acabo de 1 hora, vemos la columna de plasma que se ha formado por el descenso de los hematíes (en mm); vn de varón: 1-10 mm (primera hora); vn de mujer: 3-14 mm (porque hay menos hematíes);

Métodos  - automático (zetafuge de casa coulter)
es un sistema que utiliza la centrifugacion de unos capilares en posición vertical en 4 ciclos de 45" de duración. Los tubos se leen de forma semejante a lo de HCT (zetacrito); el calculo Hto/ Zto (mira una escala); un sistema totalmente automático "diesse" que proporciona el resultado equiparables a los obtenidos por el método de westergren; utiliza tubos especiales de plástico con anti-coagulante incorporado; tienen una forma especial como una sección rectangular estrecha en la parte anterior y superior; para la lectura se utiliza un analizador capaz de procesar un alto numero de muestras de forma simultanea; se realiza primero una agitación automática de los tubos, para seguidamente proceder a las lecturas a los 0-30-60 minutos; mediante sensores de luz infrarrojo que mide el nivel de opacidad de la columna de sangre. La segunda y la tercera lectura miden el descenso de nivel opacidad con respecto a la primera lectura.

Libro:

La membrana de los glóbulos rojos tiene una carga electrostática negativa (potencial zeta). Esta carga electrostática negativa da lugar a unas fuerzas de repulsión entre os hematíes que hacen que los eritrocitos tiendan a permanecer en suspensión, pero acaban depositándose debido a la fuerza de la gravedad en el fondo del recipiente en 3 fases: 1.fase inicial de agregación, sedimentación lenta, dura 10 minutos 2.fase de sedimentación rápida, a velocidad alta y constante, dura 40 minutos 3.fase final de concentración, se endentece, hasta el final de la segunda hora; la determinación de VSG  la rapidez con la que sedimentan los hematíes de una muestra; en condiciones patológicas con mayor facilidad y VSG aumenta. VSG = longitud del recorrido que desciende la columna de eritrocitos, desde la parte superior del tubo hacia abajo, en un intervalo de tiempo.

FISIOLOGÍA LEUCOCITARIA I

Clasificación de los leucocitos:

-según su origen: leucocitos mieloide (neutros, eusinos, basos) y linfocitos

-según la presencia de granulaciones en su citoplasma: granulocitos y agranulocitos (linfos, monos)

-según la forma de su núcleo: polimorfo nucleares (PMN) y mononucleares

-según su función: fagocitos e inmunocitos

Valores normales de total leucocitos: 5.000 – 11.000 /mm3

Neutrófilos segmentados 35-65%: 2.000-8.000 /mm3 (> neutrofilia y < neutropenia)

Neutrófilos en cayado 0-5% (> desviación a la izquierda y < desviación a la derecha)

Eosinófilos 2-4%: 0-800 /mm3 (> eosinofilia y < eosinopenia)

Basófilos 0-1%: 0-200 /mm3 (> basofilia y < basopenia)

Monocitos 3-6%: 160-1.000 /mm3 (> monocitosis y < monocitopenia)

Linfocitos (total) 20-45%: 1.000-5.000 /mm3 (>linfocitosis y < linfopenia)

Linfocitos T: 70-80% de total linfocitos; Linfocitos B 15-20% y células NK +/-10%

Granulopoyesis/el proceso de formación de los granulocitos (PMN) – neutrófilos, eosinófilos y basófilos (se clasifican según las afinidades tintoriales de sus granulaciones citoplasmáticas); núcleos no son redondeados, presentan lobulaciones, parecen tener varios núcleos (polimorfonuclear - un solo núcleo estrangulado), granulaciones citoplasmáticas visibles al Microscopio Óptico (granulocitos);

Neutrófilos:

Formación Granulopoyesis Neutrofila (leucopoyesis): dura 8-11 días  CFU GM (neutrófilos y monocitos)  CFU-G (precursor comprometido granulocítico) mieloblasto: 1a célula reconocible morfológicamente (tipo I/sin granulaciones en su citoplasma o II/finas granulaciones primarias azurófilo/rojizo), redondeado, 20-25 u, núcleo grande rojizo céntrico y ovalado con ligera hendidura, cromatina laxa, 2-5 nucleidos visibles y confluir, citoplasma escaso y ligeramente basófiloñ se divide y madura  promielocito: redondeado, 16-25 u , nucleo grandes esferico y tiende a excentrarse, cromatina laxa con nucleolos, citoplasma abundante azulado y repletos de granulos primarios azurofilos/rojos (lisosomas llenos de sustancias hidrolasas acidas, fosfatasa acida, mielooeroxidasa, muramidasa), tipo I o II, se divide varias veces y madura   mielocito neutrófilo: redondeado, 12-18 u, nucleo mas pequeño emnos redondeado mas azulado excentrico, cromatina mas condensada comienza mostrar grumos se ven nucleolos, citoplasma abundante rosado-marron con abundantes granulos especificos o secundarios de color pardo-violeta repletos de sustancias (muramidas, colagenasa, fosfatasa alcalina) y granulos primarios azurofilos; madura y se dividen varias veces tambien  metamielocito: ya no tiene capacidad mitocica, 12-15 u, citoplasma rosado, núcleo ariñónado-judía, cromatina densa-grumosa  neutrófilo en banda o en cayado (en la MO y 3-5% en la sangre periférica); núcleo se adelgaza, elonga y arquea de forma C o S sin estrangulaciones, morado oscuro en forma de herradura, el citoplasma es rosado con finas granulaciones secundarias de color pardo oscuro (ya no se sintetizan as granulaciones); en la sangre periférica ya no maduran neutrófilo segmentado: redondeado, diámetro 12-15 u, núcleo de color violeta oscuro con varios lóbulos unidos por finos puentes de cromatina, cromatina es espesa y densa, pequeño apéndice en palillo de tambor en su núcleo (cromatina sexual) en la mujer, citoplasma es acidofilo (rosado) con gránulos neutros finos parda-rosado; 10-20% primarios (lisosomas con sustancias hidrolasas acidas, fosfatasa acida, mieloperoxidasa, muramidasa) y 80-90% secundarios (sustancias muramidasa, colagenasa, fosfatasa alcalina); la fosfatasa alcalina (enzima principal, pero también hay otras importantes - lactoferrina y fosfatasa ácida) también forma parte de estructuras microsomas y fracción de la membrana; 


Regulación Neutrofila y también se cree que la baso-fila - la Granulopoyesis estimulada por: glucoproteico (factor estimulante de las colonias /FEC en ingles CSF) producido por macrófagos y linfocitos activados; dura 8-11 días; la granulopoyesis a la vez inhibida por: factores chalonas liberado por los propios granulocitos, mientras los macrófagos sintetizan prostaglandina E (PGE) que también se opone al efecto de FEC; la proliferación de neutros y monos esta equilibrado por FEC y PGE.

Cinética (8-11 días): por cada neutrófilo circulante hay de 10-15 precursores suyos en la MO; metamielocitos, segmentados en cayado y segmentados maduros en MO constituyen la reserva granulocitica medular (pool de reserva RGM); estadio (1) - maduración con proliferación: va desde la fase mieloblasto a mielocito, de manera que 1 mieloblasto ==> 8 metamielocitos /pool mitotico; estadio (2)  los metamielocitos sin capacidad mitotica sufren en 2 días un proceso de maduración que conduce a la formación del granulocitos madura (no pasan inmediatamente a la sangre periférica, sino permanecen en MO +/- 3 días; los granulocitos maduros, los cayados y los metamielocitos son pool de reserva; una parte de neutrófilos circulan con la sangre (pool granulocitos circulante o PGC) - 35-65% de total leucocitos, y el resto pegada a las paredes de los vasos (pool granulocítico marginal o PGM); PGC pueden pasar a PGM y viceversa; su vida media es de 14 días, después de 6 horas en la sangre, pasan definitivamente a los tejidos (función extra vascular) y abandonan el organismo a través de orina, saliva o destruidos en el SER; en circunstancias patológicas (leucemias) - trastornos en la producción precoz/inmaduros: los neutrófilos funcionan mal, mas tiempo en la sangre, vuelven a los tejidos y se dividen en la sangre y en los tejidos.

Función – fagocitosis (mas importante): atraídos hacia el foco infeccioso por quimiotaxinas (proteínas bacterianas péptidos formil-met-leu-phe, fracción del complemento C5a, quimitactico de neutrófilos NCF producido por mastocitos y basófilos, leucotrienos B4 producido por macrófagos)  vasodilatación y diapédesis  fagocitosis directa o tras opzonización (recubrimiento del germen con unas sustancias opsoninas como IgG y fragmento C3b del complemento; cuando el microorganismo se fija al neutrófilo  sistema actomiosinico contráctil (seudópodos/ fase de ingestión del microorganismo) alrededor del germen (formar una cavidad) se cierra (vaculo fagocítica o fagosoma)  vertidos los gránulos citoplasmáticos  el germen es destruido por diversas enzimas (peróxido de hidrógeno, mieloperoxidasa, lisozima, lactoferrina, etc.) digerido por enzimas hidroliticas  productos de degradación liberados al exterior; los neutrófilos son muy efectivos contra las bacterias piógenas (generadoras de pus) y su capacidad fagocítica puede ser inhibida por corticoides y alcohol etílico.

Eosinófilos:

Granulopoyesis Eosinófilica: (ocurre en la MO) CFU-S ==> CFU-Eo  eosinofiloblasto (1ra célula morfológicamente reconocible)  promielocito eosinófilo; los gránulos eosinófilos (pequeñas gris-pardo/ pardo-anaranjado según el grado de maduración)  pueden ocultar la gr anulación azurófila y el núcleo;    mielocito eosinófilo; (semejante a mielocito neutrófilo) citoplasma basófilo, ocupado por gránulos eosinófilos pardo-anaranjado  metamielocito, eosinófilo en cayado ==> eosinófilo segmentado: redondeado, diámetro 12-17 u, núcleo de color violeta con dos lóbulos segmentados de unión finos (aspecto anteojos / alforja), cromatina condensada en grumos; citoplasma es rosa repletos de grandes gránulos acidófilos que cubren el núcleo, que contienen sustancias (proteína básica principal (MBP), la peroxidada, fosfatasa acida, hidrolasa acida, fosfolipasa y catepsina); a diferencia de los neutros, no poseen ni lactoferrina ni fosfatasa alcalina  se tiñen con la eosina de color pardo-anaranjado; La división y maduración de CFU-Eo estimulada por un compuesto producido por linfocitos T (CSF-Eo).

Cinética - constituye 2-4%;  hay 100 veces mas abundante en los tejidos que en la sangre y ejercen de barreras frente al mundo exterior (piel, pulmón y tubo gastrointestinal); su vida media = neutrófilos; pasan a los tejidos cuando aumenta la concentración de hormonas córtico adrenales en la sangre; cuando han cumplido su función son fagocitados por los macrófagos tisulares.

Función – fagocitaría inferior que neutrófilos (parece que no fagocitan bacterias, pero si complejos Ags-Acs): atraídos al foco inflamatorios por factor quimiotáctico de eosinófilos (ECF) liberado por basófilos y mastocitos; los parásitos grandes como helmintos no pueden ser fagocitados  pero pueden estar tapizados por C3b  eosinófilos se fijan a través de sus receptores de C3b, se activa y liberan proteína básica principal (MBP) catiónica que lesiona la membrana de los parásitos (ataque extra celular); otra función - modulan reacciones alérgicas (acción de la IgE y desgranulación de sustancias de basófilos y mastocitos) in-activando las sustancias emitidas.

Basófilos:

Granulopoyesis baso-filia: posibilidad de precursor: lo mas probable cuando CFU-GM se diferencia hacia CFU-G y CFU-M, también lo haga hacia CFU-Ba; otra teoría de CFU-S sale directamente CFU-Ba  mieloblasto basófilo (1ra reconocible); nucléolos poco evidentes/no visibles, citoplasma escaso con gránulos basófilos/violeta, de diferentes tamaños, pueden ocultar el núcleo; vacuolas que proceden de gránulos disueltos  promielocito basófilo (semejante a promielocito neutrófilo)  mielocito basófilo (semejante a mielocito neutrófilo)  metamielocito basófilo - basófilo cayado - basófilo segmentado: redondeado, diámetro 12-14 u, núcleo es violeta oscuro con hendiduras de forma trébol/bilobulados, cromatina densa sin grandes grumos, citoplasma escaso de color rosa claro lleno de gránulos grandes esférica o irregular de color azul intenso (basófilos) contiene sustancias ácidas (heparina, histamina, peroxidasas y fosfatasas ácidas) y algunas vacuolas derivadas de gránulos vaciados; Los gránulos se tiñen con colorantes básicos de color azul oscuro.

Mastocitos o células cebadas – son células de tejidos conectivos, se parecen mucho a los basófilos (se cree que son basófilos modificados/transformados en los tejidos; residen en los tejidos (MO, el timo y el bazo), mientras los basófilos son circulantes: redondeada, su contorno algo poligonal, tamaño > que basófilos, núcleo esférico de color violeta en el centro, citoplasma rosado repleto de gránulos; los gránulos de citoplasma son algo mas pequeños de color azul oscuro o violeta oscuro, metacromáticos y pueden ocultar el núcleo (cambian de color según el la tinción); tienen características citoquímicas similares a basófilos.

Cinética – su vida media = neutrófilos, constituyen 0-1% de la formula leucocitaria, pasan a los tejidos cuando aumentan la concentración de hormonas córtico adrenales en la sangre.

Función – tanto mastocitos como basófilos (activado por C3a y C5a) sintetizan sustancias mediadores preformados (almacenados en sus gránulos): histamina, factor quimiotactico de eosinófilos (ECF), factor quimiotactico de neutrófilos (NCF), factor activador de las plaquetas (FAP) y interleuquinas; también sintetizan mediadores reciente sintetizados (que solo se producen tras la activación de estas células por C3a y C5a); sustancias quimiotácticas  eosinófilos/ECF y neutrófilos/NCF (inducen la migración de los eosinófilos y neutrófilos hacia el foco infeccioso, para destruir parásitos y bacterias); sustancias vasoactivas (histamina, leucotrienos y prostaglandinas) provoca  vasodilatación, aumento de flujo sanguíneo y diapédesis (brechas que se forman entre las células endoteliales), asi incrementa la llegada de los leucocitos; cuando un Ag especifico reacciona con el Ig(E) que hay en la membrana de basofilos y mastocitos ==> se libera sustancias mediadores + IgE  desgranulacion descontrolada  hipersensibilidad tipo I (alergia).

FISIOLOGIA LEUCOCITARIA II

Mononucleares – Monocitos comparten el mismo precursor comprometido que los neutrófilos (CFU-GM) CFU-LM ==> CFU-S ==> CFU-GM ==> CFU-M ; Monopoyesis – estimulada por FEC/CSF factor estimulante de las colonias): CFU GM  monoblastos (muy similar a mieloblasto neutrófilos)  promonocito (1a célula reconocible - poca capacidad fagocitica): diámetro 20-25 u, núcleo con hendidura e irregular, cromatina laxa con grumos, contiene 2-5 nucléolos visibles, citoplasma abundante (gris azulado) con finas granulaciones azurófilas/lisosomas primarios; se divide 2x y madura; solo se distinguen con promielocito  mediante técnicas citoquímicas y la proporción/relación entre citoplasma-núcleo  monocito: forma irregular y redondeada, diámetro 20-25 u, núcleo grande arriñonado, cromatina condensada, citoplasma de color basófilo claro (azul grisáceo/rosa grisáceo depende de la tinción) con finas y escasas granulaciones azurofilas cerca del núcleo con vacuolas; produce (en el aparato de Golgi): enzimas hidrolíticas peroxidasa, fosfatasa ácida, arilsulfatasa, lisozima, etc; se adapta a las formas de los hematíes (impronta de los H); los monocitos en sangre periférica 3-6% de total leucocitos (160-1000/mm3)  pool circulante y pool marginal (3,5 veces mas cantidad en el marginal que pool circulante); Monopoyesis es muy rápida (+/- 24 horas) y al contrario de granulopoyesis, el monocito salen inmaduro a la sangre periférica.

Cinética – 8 horas en circulación  emigran a los tejidos y adoptan formas de histiocitos (macrófagos); los macrófagos/histiocitos se encuentran en los espacios pleural y peritoneo, hígado, baso, donde reciben diferentes nombres; son células grandes 20-80u, se mueven lentamente, emitiendo seudopodos gigantes; los macrófagos inmaduros tienen capacidad de síntesis de ADN y la división celulares, dando el macrófagos maduros que ya no se replica; su fase hística dura varios meses y pueden dividirse; sistemas mononuclear fagocítico (SMF): conjunto de precursores monociticos medulares, monocitos sanguíneos y los histiocitos; 

Función de SMF - (a) secreciones de defensa contra ciertos microorganismos, (b) eliminación de células lesionadas y restos celulares y (c) interacción con células linfoides en ciertas fases de las reacciones inmunológicas (como células presentadoras de Ag (APC).

Mononucleares – Linfocitos

Linfopoyesis - proceso de formacion de los diversons tipos de linfocitos que comienza en MO.

Clases de linfocitos segun su morfologia - linfocitos grandes, medianos y pequeños; segun su función - linfocitos T & B.

Caracteristicas generales del Sistema Linfocitario:
- localizados en los tejidos circulantes, en la sangre o en la linfa ==> sistema celular principalmente responsable de las reacciones inmunitarias en el individuo;
- linfocitos T y B presentan un aspecto homogeneo (indistinguible morfologicamente) ==> se diferencia solo por tecnicas inmunologicas;
- celulas madres pluripotenciales ==> CFU-LM (monopotenciales) ==> linfoblastos (pro-B y To/celula pretimica; Linea T ==> linfoblasto To emigra durante su embrionaria al Timo, se madura en la zona cortical ==> T1, se desplaza a la zona medular donde se siguen madurando ==> pasan a los organos linfoides 2os para acabar de madurar y adquirir su plena inmunocompetencia al ponerse en contacto con los Ags; Linea B ==> linfoblasto pro-B permanecen y maduran en MO ==> pre-B hasta llegar a linfocito B maduro ==> pasan a la sangre hacia los organos linfoides 2os para adquirir su plena inmunocompetencia; puede retornar a MO para realizar una maduracion final.

Para ejercer como defensa inmuinologica, deben:
-ser capaz de distinguir entre Ags propios y Ags extraños (tolerancia); sin esta capacidad, podrian originar un ataque autoinmune (destruccion de las celulas propias);
-responder a nuevos Ags toda la vida mediante celulas programadas a responder a ellos;
-crear una memoria inmunologica que acelerara el proceso inmunologico ante un nuevo encuentro con el Ag en cuestion.
-tener gran movilidad para poder estar en completa y constante vigilancia;

Ontogenia del sistema linfocitario (como se desarolla)
El desarollo de sus funciones especializadas empieza y continua toda la vida, porque el sistema deben acumular informacion (memoria inmunologica) para actuar con mayor velocidad y efectividad ante los Ags; la tolerancia a los propios Ags se desarolla durante la vida fetal (sist linfo envuelto por Ags especificos y protegidos de agentes antagonicos externos; los factores de autorreconocimiento:
- la concentracion antigenica respecto a la cantidad y grado de maduracion de celulas receptoras;
- el modo y la configuracion de los Ags;
- la cantidad y funcionalidad d elas celulas complementarias que intervienen en el proceso;


Órganos linfopoyéticos primarios – MO y el timo, es organo retroesternal compuesto de corteza y medula, muy desarollado en la infacia y adolescencia y involuciona en el adulto; proporcional celulas indiferenciadas;

Órganos linfoides secundarios – el bazo, los ganglios linfáticos, el tejido linfoide asociado al intestino (placas de Peyer y apéndice cecal) y aparato respiratorio (amígdalas y adenoides); los órganos linfoides son conectados entre si mediante los vasos linfáticos.

Formación – Linfocitos T: célula madre linfoide  precursor CFU-LM (colony forming unit-lymphoid Myeloid)  linfocito To (célula T virgen o pretimica)  migran desde MO hasta la corteza del timo para madurar (influenciados por hormonas del epitelio timico)  la medula del timo (continúan madurando y adquiriendo receptores de membrana TCR y de Ag de superficie)  linfocitos T1 (maduros); algunos linfocitos To pasan directamente de MO a los ganglios linfaticos y otros órganos linfoides 2os, asi se mantiene la inmunidad celular tras la atrofia del tipo (acontece en la pubertad);  durante su maduracion el linfocito T solo se prepara para reconocer Ags extraños; si reconoce algun compuesto de complejo mayor de histocompatibilidad (MCH) o Ags propios ==> se autodestruye;


MCH => un grupo de genes en el brazo corto del cromosoma 6 que codifican la sintesis de Ags de histocompatibilidad/HLA (proteinas) o Ags de superficie de leucocitos humanos; HLA => intervienen en muchos procesos inmunes/el control de la respuesta inmune (interaccion entre celulas linfoides y entre los linfocitos y celulas presentadoras de Ags, etc.); reconocimiento de los Ags ==> Ags deben estar unidos a una molecula de MCH procedente de la celula presentadora de Ag; MCH se clasifican:
- clase I: codifican Ags HLA de clase I (HLA A,B,C,G...en todas las celulas nucleadas, plaquetas y espermatozoides, excepto celulas del sistema nervioso);
- clase II: codifican Ags HLA de clase II (HLA D, DR, DQ...en los macrofagos, linfocitos B, celulas epiteliales, celulas de Langerhans);
- clase III: codifican proteinas del sistema del complemento (C2, C4...)


Tras su migracion hacia los organos linfoides 2os (bazo, ganglios linfaticos, organos/tejidos linfoides intestinales y respiratorios) + estimulacion antigenica ==> adquieren su plena capacidad inmunocompetente y se diferencian en:
- linfocito Th o helper o auxiliador: interacciona con Ag presentado por el macrofago y estimula al linfocito B, para producir Acs y estimula al linfocito Tc (citotoxico);
- linfocito Tc o citotoxico o killer: provocan lisis celular de diferentes celulas Ags.
- linfocito Tm o de memoria: acelera la marcha la inmunidad celular;
los Ags de superficie sirven para diferenciar los linfocitos T ==> todos tienen CD3; CD4 solo esta presente en los T helper; CD8 expresados en los T supresores y los T citotoxicos (morfologicamente todos son iguales).


Cinetica - Linfocitos B y T predominantes de los ganglios (tambien hay macrofagos y plasmocitos); salen y entran varias veces de la circulacion sanguinea (70% de total formula linfocitaria) hacia la linfa viceversa (tambien son celulas predominante de la linfa); la duracion de la vida media - los linfocitos To del timo son cortas 10-20 dias y los de los organos perifericos dura varios meses y puede alcanzar años entre 2 mitosis; si las celulas no se encuentran en este tiempo el Ag correspondiente, esto permite la conservacion de la memoria inmunologica y la reaccion secundaria frente un Ag ya conocido aunque sea mucho tiempo antes; algunos se transforman tras los estimulos antigenicos, otros se pierden a traves del tracto respiratorio y digestivo; la mayor parte son fagocitados por macrofagos en los ganglios.

Función - los LTm cuando entran nuevamente en contacto con el Ag, acelera la marcha de la respuesta inmunitaria celular; Los LTc - lisan las celulas dianal, cuya membrana esta el Ag; Los LTs inactivan a otros linfocitos; Los LTh reconocen los Ags extraños y ayudan a activar a los LTc y los LB; Los linfocitos T son los responsables de la inmunidad celular e intervienen en los siguentes procesos:
- defensa contra los germenes intracelulares (brucelal, bacilo tuberculosos y virus)
- lucha contra el desarollo de neoplasias
- reacciones de rechazo a los transplantes (debido a HLA/ Ags de histocompatibilidad de superficie de leucocitos humanos);
- hipersensibilidad tipo IV ==> reacciones inmunologicas exageradas frente a un Ag que produce lesiones en los tejidos de sujetos que lo padecen, mediado por células y retardadas en el tiempo, a diferencia de las otras hipersensibilidades (I, II, III y V que son mas inmediatas y mediadas por Acs).

Formación - linfocitos B: comienza en MO; celula madre pluripotencial => CFU-LM (se dividen y maduran) => pro-B + la interaccion de celulas estromales (celulas grandes con proyecciones) mediante IL y moleculas de superficie => division, diferenciacion y adquisicion de receptores de superficie de Ig => pre-B (codifican la sintesis de las cadenas pesadas y posteriormente las cadenas ligeras) => empieza la sintesis de las Igs y proteinas (Ig alfa y Ig beta); los Igs juntos avanzan hacia la superficie celular hasta colocarse en la membrana => linfocito B inmaduro; durante la maduracion pre-B también adquieren otros receptores de membrana:
- receptores para el fragmento Fc de algunas Igs (IgG)
- receptores para algunos commponentes del complemento (C3)
- receptores para los hematies del raton;
ademas, en toda su superficie, Linfocitos B expresan moleculas de clase II del HLA (fundamental para reconocimiento del Ag); las celulas B tambien se suicidan para evitar las reacciones auto inmunes; a través de este proceso se consigue una población de Linfocitos B capacitada para reaccionar ante una amplísima gama de Ags; cuando las células B recién formadas interaccionan con el entorno y reconocen Ags propios (al reaccionar sus receptores con las células vecinas), reciben una señal y se suicidan (para evitar las reacciones auto inmunes); las células B que sobreviven a esta selección, maduran y dan lugar a clones de linfocitos B que pasan ==> sangre ==> los órganos linfoides 2os ubicándose en bazo y ganglios linfáticos; allí, los macrófagos existentes les presentan los Ags ==> se activan con ayuda de linfocitos Th; posteriormente linfocitos B pueden retornar a MO para una maduración final (mutación para que las Ig sintetizadas sean mucho mas especificas contra el Ag que provoque su activación); cuando los linfocitos B se activan (inmunoblastos), pueden transformarse => célula plasmáticas (formadoras de Acs) o => linfocitos de memoria (Bm) que tiene una vida media muy larga y ante un posterior estimulo antigénico de la misma naturaleza que recibió anteriormente, son capaces de dividirse y diferenciarse con mucha rapidez => células plasmáticas.

Cinética - linfocitos B pasan desde los órganos linfoides hacia la sangre donde constituyen aproximadamente 30% de todos los linfocitos; re-circulan menos que los linfocito T y su vida media es también algo menor.

Función - la principal es la formación de los Acs, que tiene como función: neutralizar los Ags, marcaje de células extrañas para que sean atacadas por otros leucocitos, destrucción de germenes extra celulares; a esta función se le domina inmunidad humoral.

Morfología de los linfocitos - los linfocitos suponen entre 25-40% de los leucocitos de la sangre (1000-5000/mm3); (1) morfológicamente son indistinguibles entre ellos, y presentan las siguientes características:
- son redondeados, tamaño de los pequeños 7-8 u y de los grandes hasta 16u; LT algo mayor que LB;
- núcleo redondeado, cromatina densa y homogénea
- citoplasma escaso en linfocitos pequeños y algo mas abundante en los grandes, basófilo ligero (azul claro) y sobre todo los T, pueden tener algunas granulaciones azurófilas sin actividad peroxidásica.

(2)Cuando los linfocitos se activan por el contacto con el Ag (linfocitos activados/inmunoblastos), sufren una transformación que hace modificar su morfología; esta activación hace que haya una síntesis activa de DNA y proteínas que origina multiplicación por mitosis y desarrollo de un aparato funcional en citoplasma:
- su tamaño aumenta hasta los 15-25 micras
- su núcleo es redondo y grande, con cromatina laxa y con nucléolos prominentes, excéntrico
- su citoplasma se torna abundante y muy basófilo (azul oscuro) sin gránulos, ademas se adapta a los hematíes del entorno;
los auto analizadores las agrupan bajo el termino de células LUC.

(3)Tras mitosis sucesivas, el inmunoblastos de origen B dando lugar a células plasmáticas o plasmocitos:
- son redondeadas u ovaladas, tamaño entre 15-25 micras
- su núcleo es redondo u ovalado, pequeño y excéntrico, cromatina agrupada en forma radial (imagen-rueda de carro), no contiene nucléolos
- su citoplasma es abundante, muy basófilo y puede contener vacuolas pero no gránulos; el área peri nuclear se tiñe débilmente;
estas células no se encuentran en sangre periférica excepto en estados patológicos (infecciones crónicas como TBC, alérgicas, miolema múltiple, sarampión y otras viriasis etc.); su emplazamiento son los órganos linfoides 2os; su función es la secreción de Acs (el paso de linfocitos B => plasmocitos se debe a las estimulaciones anti génicas en todos los órganos periféricos y MO; tras la secreción de los Acs, plasmocitos son destruidos in situ.

La manera de poder distinguir las diferentes poblaciones linfocitarias es por técnicas inmunológicas (poniendo en evidencia sus marcadores de superficie) y por algunas técnicas citoquímicas.

Regulación de la actividad linfocitarias - existen muchos mecanismos de regulación, pero el mas importante es la regulación por citoquinas (polipéptidos que actúan como mensajeros intercelulares); cuando son producidas por los linfocitos => linfoquinas; los mas importantes son:
- MIF factor inhibidor de los macrófagos (secretado por LT activados) promueven el acumulo de los macrófagos en el foco inflamatorio.
- IFN interferón gamma (secretado por LT activados) aumenta la capacidad de los macrófagos para presentar el Ag a los LB.
- Interleucina 1 (IL-1 generada por los macrófagos) interviene en la activación de losLT y B
- Interleucina 2 (IL-2 secretado por LThelper) potencia la división de los LT y B
- Interleucina 4,5 y 6 (IL-4, IL-5 y IL-6 secretadas por los LT) estimulan la división de los LB, su diferenciación hacia células plasmáticas y la producción de Acs.
- Interleucina 7 (IL-7 secretada por células estromales de la MO) estimula la proliferación de las células pro-B, pre-B y de los LT maduros activados.


Practica XXVII (recuento de leucocitos (WBC)

Material: pipeta diluidota de Thoma para glóbulos blancos

Reactivos: el liquido de dilución Turck; el acido acético que contiene produce la lisis de los eritrocitos sin alterar a los leucocictos; el violeta de genciana tiñe el núcleo de los leucocitos para que estos puedan observarse mejor;

Muestra: la misma que en el RBC

Técnica: la misma que en el recuento de hematíes, pero se cuentan los leucocitos presentes en los 4 cuadrados grandes de las esquinas del retículo (cada uno de ellos esta dividido a su vez en 16 cuadrados medianos); si los leucocitos se ven bien, se pueden contar con el objetivo de 10x.

Lectura: se cuentan los leucocitos presentes en 4 cuadrados grandes y dividir por 4 (la media); longitud del espacio comprendido entre estos y el cubre es de 0,1 mm, hay que multiplicar por 10 el resultado anterior; previamente la sangre se diluye, hay que multiplicar el resultado anterior por 10 si la sangre se ha enrasado hasta el 1 o multiplicar por 20 si se ha enrasado hasta 0,5; la formula:

WBC = (L / 4) x 10 x D (dilución)

Práctica XXVIII (formula leucocitaria)

La formula leucocitaria o recuente diferencial leucocitario (RDL): determinación del porcentaje que representa cada uno de los tipos de leucocitos con respecto al total de ellos;

Material: microscopio, papel y lápiz o registrador automático de células (un apto que tiene unas teclas; cada tecla representa a un tipo d leucocito y hace anotación cada vez que es presionada; cuando el numero de anotaciones llega a 100, suena una alarma).

Reactivos: aceite de inmersión

Muestra: extensión de sangre teñida con un colorante de uso habitual (panóptico)

Técnica: preparar el microscopio para que tenga el condensador alto y el diafragma abierto; enfocar la preparación con el objetivo de 10x; comprobar que la preparación es buena y elegir una zona en la que los hematíes no estén superpuestos y los leucocitos se encuentren uniformemente distribuidos; enfocar esa zona de la preparación con el objetivo de inmersión; observar esa zona mientras se descrie un recorrido en forma de almenas o de greca; simultáneamente a esto, se clasifican y se cuentan los leucocitos que se van encontrando alo largo de ese recorrido;

Lectura de resultados: solo se cuentan 100 leucocitos o máximo 200; si se conoce el WBC de la sangre, se puede calcular el numero de cada uno de los tipos de leucocitos que esta presente en 1 mm3 de sangre, con la formula:

no TL = WBC x % TL

100

no TL= numero de un tipo de leucocito por mm3 de sangre (valor absoluto)

WBC = recuento d leucocitos (numero de leucocitos por mm3 de sangre)

%TL = porcentaje que representa ese tipo de leucocito con respecto al resto (valor relativo)

Hay que tener en cuenta que hasta los 4 años de vida se observa una inversión de la formula leucocitaria (mas linfocitos que neutrófilos);

Total leucocitos (valor normales) 5.000 – 11.000 /mm3

Neutrófilos segmentados 35–65 %  (2.000 – 8.000 /mm3)

Neutrófilos en cayado 0–5 %

Eosinófilos 2–4 %  (0 – 800 /mm3)

Basófilos 0–1 %  (0–200 /mm3)

Monocitos 3–6 %  (160–1.000 /mm3)

Linfocitos (total) 20 – 45 %  (1.000 – 5.000 /mm3)

Linfocitos T 70 – 80 % de total linfocitos

Linfocitos B 15 – 20 % de total linfocitos

Células NK +/- 10% de total linfocitos

Índices Leucocitario


parámetros que sirven para evaluar el grado de madurez de los leucocitos en concreto de los neutrófilos en la sangre periférica; no se tienen en cuenta las formas juveniles y maduras de los eosinófilos y de los basófilos debido su menor presencia;

Recuento de Schilling – cuantificar el numero de formas juveniles y el de formas maduras de los neutrófilos en la sangre periférica y relacionar ambos valores; clasificación de Schilling (2 grupos): formas juveniles (mielocitos 0%, metamielocitos 0-1% y neutrófilos en banda o en cayado 0-5%) y formas maduras (neutrófilos segmentados 35-65%); ante la duda, se incluye siempre en la categoría mas madura; calculo: Índice de Schilling => % de formas juveniles     (1/16)

                                                                  % de formas maduras

valoración normal del índice de Schilling 1 forma juvenil = por cada 16 formas maduras de neutrófilos; cuando > % formas juveniles  desviación a la izquierda y cuando > % de formas maduras  desviación a la derecha.

Recuento de Arneth – contar el numero de lobulaciones que tiene una cantidad determinada de neutrófilos y calcular el numero de lóbulos que hay por cada neutrófilo; suele hacerse con auto-analizadores (Indice de Lobularidad) ; clasificación: tipo 1-neutrófilos con núcleo no segmentado (sin lobulaciones), tipo 2,3,4,y5-neutrófilos con núcleo de 2 lóbulos, 3,4,5 respectivamente; calculo: se calcula el numero de cada tipo de Arneth, por tanto es posible saber el numero de lóbulos por neutrófilo; los modernos auto-analizadores hematológicos proporcionan esta cifra (índice de lobularidad (IL) => no.de lóbulos contados
                                 no. de neutrófilos observados (en este caso 100)

Valoración de IL normal: 1,9-3  (<1,9 => desviación a la izquierda; >3 => desviación a la derecha)

Técnicas histoquímicas de identificación leucocitaria


permiten la identificación de ciertas sustancias presentes en la célula, detectar y localizar enzimas y sustancias inorgánicas, establecer con mayor exactitud el grado de maduración y funcionalidad de las células, validas para el diagnostico de distintas leucemias y evaluar el tratamiento antileucémico; tres procesos fundamentales: fijación, extensión, incubación y tinción de contraste.

Fijación de la extensión – evitar el deterioro celular e impedir la difusión de sustancias al medio extracelular; fijador: el metanol, el etanol, la acetona => coagulando las proteínas celulares; formaldehído y glutaraldehido => actúan formando puentes intra e inter-proteicos; es importante eliminar bien los restos de fijador para evitar interacciones con el compuesto que deseamos analizar.

Incubación – tiempo de reacción que da lugar a un precipitado apreciable al microscopio óptico; en caso de identificación de enzimas, debemos controlar bien el pH y la temperatura para optimizar la reacción.

Tinción de contraste – facilitar la identificación morfológica de la célula en la que se ha producido la reacción; en el caso de observadores muy experimentados se puede suprimir este tercer paso.

Tipos de reacciones:
1-tinción del ácido peryódico de Schiff (PAS) – se hacen mucho!! sirve para la identificación de carbohidrato (el glucógeno, muco polisacáridos, muco proteínas, glucoproteinas y glucolípidos) en el citoplasma celular; da lugar a un precipitado de color rojo-púrpura intenso (PAS positivas): (+) en polinucleares neutrófilos (negativa hasta el mielocito y débilmente positiva en el metamielocito), (+) en basófilos; es útil para el diagnostico de algunos tipos de LLA (formación de mazacotes en los blastos) y eritroleucemia (positividad difusa en los eritroblastos).

2-tinción de la peroxidasa – (el mas importante!!) detecta la presencia de la enzima peroxidasa en el citoplasma celular; da lugar a un precipitado rojo-marrón en los leucocitos que contienen peroxidasa; en los eosinófilos => amarillo-marrón (muy intenso); en base a la actividad peroxidasa de cada tipo leucocitario => formula leucocitaria tal como la hacen los auto-analizadores.
linfocitos => células mas pequeñas y carecen de actividad peroxidásica, 
monocitos => ligeramente mayores con mas peroxidasa, 
neutrófilos => son de menor tamaño y ricos en peroxidasa, 
eosinófilos => de mayor tamaño que neutrófilos y son muy cargados de peroxidasa, 
LUC (large unstained cells) => celulas de gran tamaño, no teñidas, presentes en la sangre +/- 4% y sin actividad peroxidasica: linfocitos hiperactivos, células patológicas linfoblastos, mieloblastos etc.;


MPXI o IMPX (índice de actividad peroxidásica media de la población de neutrófilos): valor por de bajo de normal => patología de la serie mieloide – un déficit congénito o adquirido; valor por encima de normal => una gran presencia de cayados; 
la tinción de la peroxidasa - es útil para clasificar los leucocitos y diferenciar los blastos de estirpe mieloide de los de estirpe linfoide en LMA; se tiñen bien los cuerpos de Auer de los blastos en LMA.
Los basófilos tienen actividad peroxidasa baja, se cuentan mediante Indice Lobularidad poniendo un sulfactante en el medio que destruirán las membrana de citoplasma de las células a excepción de los basófilos, así, se pueden contar el no.de basófilos que hay y ademas se puede determinar el no.de lóbulos de las demás.

3-tinción de la fosfatasa alcalina leucocitaria (FAL) o granulocitaria (FAG) – es una enzima en los gránulos secundarios de los leucocitos polimorfo nucleares (neutrófilos maduros o en banda); los basófilos y los eosinófilos no la poseen; es útil en el diagnostico diferencial de algunos síndromes mieloproliferativos (en LMC el FAG es muy bajo y en policitemia vera el FAG es muy elevado); un resultado positivo (+) con esta tinción => cuando se aprecia la granulaciones de color marrón negruzco.

4-tinción del negro Sudan B – sirve para identificar lípidos

ALTERACIONES DE LOS LEUCOCITOS

Alteraciones del número:

Leucopenia o leucocitopenia – cuando la cifra de total leucocitos < 4.000 /mm3 (descenso absoluto-numero total de ellos o relativo-% que representan con respecto al resto).

Leucocitosis – si la cifra 11.000 – 25.000 /mm3 (absoluto o relativo); cuando supera los 25.000 /mm3 se dice reacción hiperleucocitosica y si además se encuentran formas anormales (no blasticas), se dice reacción leucemoide causado por recuperación de la agranulocitosis (por muchos casos), mononucleosis infecciosa (vírica), linfocitosis aguda benigna.

Agranulocitosis – intensa disminución incluso desaparición de los granulocitos; idiopática o secundaria a infecciones (tuberculosis, sida), radiaciones y sustancias toxicas; suele acarrear infecciones  con fiebre.
Pancitopenia – agranulocitosis acompañada por anemia y trombopenia, típica de las a.aplásicas.

Neutropenia – disminución de neutrófilos por causa de agranulocitosis, a.aplásicas/pancitopenia (falla la producción en MO), a.megaloblástica y algunas infecciones intracelular (fiebre tifoidea, brucelosis, hepatitis vírica, etc.).

Neutrofilia – aumento de neutrófilos (>70%) en los casos: infecciones bacterianas (sepsis), terapias (corticoides o litio), fisiológicamente => ejercicio físico intenso y ansiedad.

Eosinopenia – disminución de eosinófilo por causas: la mayoría de infecciones (en fase de lucha),  tratamiento (corticoides, adrenalina).

Eosinofilia – aumento de eosinófilos en circunstancias: infecciones agudas (escarlatina, sarampión) y crónicas (meningitis tuberculosa, lepra), infestaciones parasitarias (helmintos), alergias, situación fisiológica (menstruación, embarazo, ejercicio intenso y corto).

Basopenia – disminución de basófilos en casos: infecciones;

Basofilia – aumento de basófilos en circunstancias: infecciones víricas, asma.

Monocitopenia – disminución de monocitos en casos: leucemia de células peludas (tricoleucemia),  tratamiento con esteroides (corticoides).

Monocitosis – aumento de monocitos causados por: infecciones agudas (fase de recuperación de muchas infecciones) infestaciones parasitarias.

Linfopenia – disminución de linfocitos en casos: inmunodeficiencia congénitas o adquiridas => sida, tratamiento inmunosupresores antes de los transplantes, linfomas;

Linfocitosis – aumento de linfocitos causados por: infecciones víricas (paperas, varicela, sarampión, rubéola, hepatitis), fisiológica en niños de 0-5 años, LLA/LLC.

Plasmocitosis – aparición de células plasmáticas en la sangre periférica (no tienen que estar - son linfocitos B activado/célula efectora que se diferencia por el color de citoplasma); se produce en condiciones: infecciones (rubéola, mononucleosis infecciosa), plasmocitoma (leucemia de células plasmáticas).

Alteraciones de la forma del núcleo:

Linfocitos con núcleo hendido o mellado – típico de linfomas linfocítico en fase leucémica y LLC.

Leucocitos con núcleo cerebriforme – linfocitos Th morfológicamente modificados /células Lutzner en síndrome de Sezary-fase leucémica de una micosis fungoide (linfoma de células T con erupción pruriginosa crónica).

Anomalía de Pelger-Huet – anomalía hereditaria; se encuentran muchos neutrófilos en cayado o, predominantemente con 2 lóbulos y cromatina densa (hiposegmentado);

Neutrófilos híper segmentados – neutrófilos grandes con núcleos hípersegmentados; en las anemias megaloblástica;

Alteraciones de la forma del citoplasma:

Células peludas – linfocitos con proyecciones citoplasmáticas y aspecto de pelos; típicas de la leucemia de células peludas o tricoleucemia y leucemia linfocítica.

Linfocitos hiperbasofilos – incremento de la basofilia en su citoplasma; son linfocitos activados / inmunoblastos en las infecciones víricas.

Neutrófilos con granulaciones toxica – aumento del tamaño y intensidad en la coloración de los gránulos de neutrófilos + otros granulocitos; se produce en las infecciones bacterianas.

Blastos con bastones de Auer - los bastones de Auer son agrupaciones de gránulos 1os anormales que adoptan forma de aguja, rojo violáceo; en el citoplasma de los blastos LMA

Células LE – leucocitos que contienen un núcleo fagocitado con morfológicas anormal (esta hialinizado); características del lupus eritematoso diseminado;

PATOLOGÍA LEUCOCITARIA I

Leucemias – conjunto de neoplasias malignas que consisten en la proliferación excesiva (leucocitosis) de células sanguíneas inmaduras en la sangre periférica de algún tipo de leucocito; el termino inventado por Virchow; algunos trastornos están limitados a la medula ósea (leucosis); causas desconocidas, pero hay factores genéticos y ambientales;

Las enfermedades preleucemicas: anemias sideroacresticas adquiridas, anemias aplasicas, anemias megaloblasticas refractarias al tratamiento, hemoglobinuria peroxistica nocturna y policitemia vera.

Factores genéticos: mayor incidencia con alteraciones cromosomitas, afectaciones ente gemelos univitelinos y ausencia de leucemia linfática crónica entre los japoneses;

Los genes en el desarrollo de los tumores malignos:

-los oncogenes

-los genes tumor supresores o antioncogenes

-los genes de supervivencia (inhiben la apoptosis)

Factores ambientales: pueden ser físicos, químicos o víricos; físicos – exposición a radiaciones ionizantes (explosiones nucleares); químicos – exposición a productos cancerigenos (benceno); víricos – la asociación entre el virus linfotropico de células T humanas (HTLV-I) y algunas leucemias de linfocitos T; virus de Epstein-Barr relacionado con el linfoma de Burkitt;

Patógenia: en leucemias, la expansión clonal maligna se origina en una sola célula hematopoyética precursora en la MO que da lugar a una progenie de células anormales con alteraciones cromosomitas; presentan un grado variable de inmadurez e indiferenciacion, crecimiento autónomo y perdida de sus funciones  pasan a la sangre periférica, se acumulan y permanecen mas tiempo de lo normal  invaden órganos como hígado, bazo, ganglios linfáticos, riñones, testículos y meninges, se dividen y posteriormente retornar al torrente sanguíneo.

Manifestaciones clínicas: aumento de la celularidad en la MO produce dolor óseo (ocupan el espacio medular y produce supresión de hematopoyesis normal que origina anemia, trombocitopenia, descenso de granulocitos normales); trombocitopenia produce hemorragias y granulocitopenia provoca eclosión de infecciones y fiebre; infiltración de órganos manifiesta hepatomegalia, esplenomegalia y adenopatías; infiltración de la meninges origina hipertensión intracraneal; el tratamiento produce un aumento de la destrucción celular que ocasiona hiperuricemia que puede producir cálculos renales de acido úrico;

Tratamiento: radioterapia, quimioterapia (fármacos antineoplásicos), transplante de medula ósea, medidas paliativas.

Clasificación leucemias: agudas (proliferan células muy inmaduras e indiferenciadas) y crónicas (proliferan células bastante maduras y diferenciadas); mieloide y linfoides. Las subclases depende de los criterios: morfológicos, histoquímicos, inmunológicos, genéticos.

Leucemias mieloide aguda / LMA – mas frecuente en el adulto; hiato leucémico (presencia en la sangre periférica de numerosos blastos leucémicos coexistiendo con escasos granulocitos maduros y ausencia de células intermedias = parada en la diferenciación en etapa muy temprana); pueden contener bastones de Auer; suele cursar con anemia y trombocitopenia graves; puede originar esplenomegalia y linfadenopatía; pronostico sombro (con tratamiento se obtienen remisiones y la curación del 10-30% de los pacientes afectados). Los blastos de la LMA según los criterios morfológicos: M1 – M7.

Leucemia linfoide aguda / LLA – frecuente en la infancia; se produce hiato leucémico; cursa con anemia y trombocitopenia graves, origina esplenomegalia y linfadenopatía; afecta a las meninges; pronostico malo (con el tratamiento actual, se obtienen remisiones y la curación en mas de 50% de los casos). Los blastos de la LLA según las características morfológicas: L1 – L3.

Leucemia mieloide crónica / LMC – frecuente en el adulto joven; una gran leucocitosis con desviación a la izquierda, basofilia, eosinofilia y anemia leve; Los hallazgos hematológicos en la LMC dependen de la fase evolutiva (fase temprana, fase crónica, fase acelerada, fase final /crisis blastica); anomalías cromosomitas (presencia del cromosoma Filadelfia (Ph); cursa con esplenomegalia; pronostico malo (tratamiento paliativo con citostaticos busulfa e interferón o curativo = transplante de medula ósea; suelen conducir a la muerte.

Leucemia linfoide crónica / LLC – frecuente en personas de edad avanzada; permanecer mucho tiempo asintomático; leucocitosis muy intensa de linfocitos pequeños parcialmente hendido y frágiles dan lugar a las sombras nucleares de Gumprecht en las extensiones; presencia de células blastoides (parainmunoblastos), cursa con anemia leve, trombopenia, esplenomegalia, linfadenopatía y hipogammaglobulinemia; pronostico bueno (el tratamiento corticoides prednisona asociados a citostaticos clorambucil); un tipo especial de LLC es leucemia de células peludas / tricoleucemia que se suele complicar con vasculitis, pronostico variable, se trata con esplenectomia e interferón.

Mononucleosis Infecciosa / MNI – originada por el virus de Epstein-Barr /EBV o VEB (es linfotropo, pertenece al grupo de los herpes) y también una infección por citomegalovirus (CMV); dos picos de incidencia (niños en guarderías y adolescentes); es poco contagiosa, alcanza la faringe (epitelio faríngeo) a través de la saliva  células epiteliales (componente C3d del complemento)  ganglios linfáticos (infecta linfocitos B y destruirlos/infección lítica o incorporarse a su genoma/infección latente)  división linfocitos B, transformarse  Inmunoblastos B  células plasmáticas  inmunoglobulinas  activación de linfocitos T  linfocitos T CD8+  frenar el virus.

Manifestaciones clínicas – incubación 4-8 semanas posteriormente pródromos con estado gripal: fiebre alta, faringitis con petequias, puntiformes en el paladar, adenopatías cérvico-occipitales dolorosas, esplenomegalia, hepatomegalia; asociación clara entre EBV y linfoma de Burkitt africano.

Datos de laboratorio – linfocitosis absoluta y relativa con 20% linfocitos atípicos (linfocitos T activados): tamaño y afinidades tintoriales variables, núcleo oval, arriñonado, lobulado, excéntrico y con nucleolos, citoplasma contiene vacuolas con aspecto monocitoide; 2 tipos de anticuerpos: Ac heterofilos (IgM) en las 2 primeras semanas de la enfermedad + Ac específicos IgM anti VCA (viral capside antigen); después 3 semanas y 3 meses aparecen IgG anti EBNA (Ebstein-Barr Nuclear Antigen); posteriormente aparecen IgG anti VCA y permanecen durante toda la vida del paciente.

Pronostico – enfermedad autolimitada, pero si se complica con rotura esplénica (requiere la extirpación quirúrgica del bazo) o pericarditis, puede conducir a la muerte.

Tratamiento – reposo y antitérmico (paracetamol), en casos complicados se administra corticoide o aciclovir.

Linfomas – neoplasias malignas que afectan al tejido linforreticular: enfermedad de Hodgkin y linfomas no Hodgkinianos (LNH).

Enfermedad de Hodkin – linfoma mas frecuente con etiología desconocida; cuadro clínico: perdida de peso, prurito, sudoración nocturna, Fiebre de Pel-Ebstein (alternando durante varios días o semanas temperatura corporal alta y otros es normal o baja); linfadenopatía indoloras localización cervical y posteriormente supraclaviculares, los axilares, los mediastinitos e inguinales y por ultimo en zonas no accesibles; desencadenamiento de dolor por las bebidas alcohólicas; existe 4 subgrupos de enfermedad de Hodgkin según la imagen histológica (clasificación de Rye) y 4 estadios según su grado de extensión (estadio de Ann Arbor); célula característica de Sternberg-Reed que se encuentra en los ganglios linfáticos: seudópodos gruesos, gran tamaño diámetro 25-50 u, núcleo grande y polilobulado, membrana nuclear irregular y espesa, cromatina nuclear reticulada con varios nucleolos, citoplasma abundante, carente de gránulos con vacuolas; cursa con anemia, leucocitosis y linfopenia; VSG (velocidad de sedimentación globular) elevada; defectos en la inmunidad con frecuente infecciones; 70% de pacientes se curan con tratamiento de radioterapia combinada o no con citostaticos.

Linfomas no Hodgkinianos (LNH) – etiología desconocida, pero clara asociación con virus: Epstein-Barr (linfoma de Burkitt africano), HTLV-I (linfoma de células T de adulto), infección VIH; 90% son de tipo celular B con anomalías cromosomitas; cuadros clínico: puede producir síndromes compresivos (síndrome de la vena cava superior), pueden localizarse fuera de los ganglios linfáticos (en MO o en el intestino); se clasifican en 4 estadios según el grado de extensión; se caracterizas por destrucción de la estructura normal de los ganglios linfáticos con invasión de su capsula y de la grasa adyacente por células neoplásicas (centroblastos, centrocitos o inmunoblastos y linfocitos hendidos en sangre periférica); VSG elevada con hipogammaglobulinemia; menos de 30% se curan, radioterapia solo efectiva en el estadio I y el resto se basa en citostaticos; La micosis fungoide es un linfoma de células T que afecta la piel con fase leucémica (síndrome de Sezary).

Neoplasias Malignas (discrasias) de Células Plasmáticas – conjunto de enfermedades de proliferación excesiva de una familia o clon de células plasmáticas, híper producción anómala de una Ig o fracción de una Ig que electroforeticamente a través de proteínas sericas, es homogénea (Ig monoclonal/ uniformidad); la clase de Ig o del tipo de cadena hiperproducida en el suero (paraproteinemia) se aclara mediante inmuno electroforesis; híper producción monoclonal de una Ig causa el descenso en la fabricación del resto y mayor propensión al desarrollo de infecciones; se distinguen en 3 clases: mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y la enfermedad de las cadenas pesadas; suelen aparecer en ancianos.

Mieloma múltiple – es un tumor de células plasmáticas ubicado principalmente en la MO, se puede infiltrar a los órganos internos; híper producción monoclonal de Ig completa (IgG, IgA o IgD) o/y de una cadena ligera aislada (kappa o lambda), se conoce como proteína de Bence-Jones; Plasmocitoma: si las células plasmáticas anormales constituyen una masa tumoral solitaria; síntoma clínico mas común: dolor óseo (osteoporosis difusa y lesiones osteoliticas) en la pelvis, vértebras, costillas, huesos del cráneo; las radiografías muestran lesiones líticas “en sacabocados”; hipercalcemia (> calcio serico); hiperproteinemia + viscosidad sanguínea; crioglobulina (precipitación a baja temperatura y sensibilidad especial al frío/ síndrome de Raynaud); aglutinación de los hematíes (lesiones en forma de salchichas en venas retinianas); proteinuria de Bence-Jones de cadenas ligeras de Ig  atrofia de las células del epitelio tubular  fibrosis intersticial  insuficiencia renal; deposito de material amiloideo en los nervios; en la sangre periférica: anemia moderada, hematíes en pilas de monedas (seudoaglutinacion) y aumento VSG; en la MO: proliferación de células plasmáticas anómalas en nidos, núcleo inmaduro y nucleolos evidentes; tratamiento de corticoides (prednisona) y citostaticos alquilantes (ciclofosfamida), no se cura.

Macroglobulinemia de Waldenstrom – es un tumor de células linfoplasmocitoides asociada a linfadenopatía y hepato-esplenomegalia con híper producción monoclonal de IgM; intensa hiperviscosidad sanguínea; precipitación a baja temperatura o ataca IgG autóloga (factor reumatoide) o ataca eritrocitos con el frío (crioaglutinina); en la sangre periférica: anemia moderada, hematíes en pilas de monedas, aumento VSG; en la MO: abundante los mastocitos histicos basófilos; pronostico benigno, tratamiento: reducir la viscosidad sanguínea mediante plasmaferesis y citostaticos alquilantes.

HEMOSTASIA

FISIOLOGÍA PLAQUETARIA

Trombopoyesis (estimulada por factor CSF-M) - el proceso total 4-5 días: Celula Madre Pluripotente =j> CFU-LM => CFU-S => BFU-EM  CFU-MEG  megacarioblasto (1a celula de morfologia reconocible; contorno desflecado y suelen tener plaquetas adheridas a su superficieñ diametro 25-40 micras; nucleo grande-ovalado-unico o 2-4 nucleos; cromatina laxa-homogenea con varios nucleolos que no suelen verse; citoplasma muy basofilo con granulos y seudopodos); se madura mediante divisiones mitoticas del nucleo/endomitosis/celulas poliploides gigantes/multilobulado, incremento del volumen y de la basofilia del citoplasma y aparición de granulos, tubulos y microfilalmentos   promegacariocito o megacariocito semimaduro o megacariocito basofilo (diametro 30-50 micras; nucleo gigante y multilobulado, cromatina densa sin nucleolos visibles; citoplasma basofilo, aspecto desflecado con plaquetas adheridas a su superficie  megacariocito maduro o megacariocito acidofilo (forma redondeada, diametro 80-100 micras, nucleo multilobulado, algunos son pequeños/microcariocitos, cromatina densa, citoplasma abundante de color grisaceo repleto de granulos azurofilos; a veces se observan emperipolesis y membranas de demarcasion) => meta-megacariocitos   (con la presencia de trombocitos en su interior apreciado)  explosión citoplasmática (los nucleos son fagocitados por SRE  un megacariocito da lugar a miles de plaquetas o trombocitos: fragmentos del citoplasma de los megacariocitos; formación plaquetas es activada por trombopoyetina, sintetizada por el riñón y interleuquina e (IL3); factor inhibidor sintetizadas por las propias plaquetas y hormonas (estrógenos y corticosteroides).

Morfologías – forma variable, tamaño 1-4 u de diámetro, carecen de núcleo, citoplasma se tiñe de color rosa y contiene pequeños gránulos púrpura en la área central (granulómera o cromómera) o periférica (hialómera); citoplasma con tentáculos (seudópodos); se adhieren (conglomerados plaquetarios) en el extremo final de las extensiones sanguíneas.

Estructura interna:

1-Zona periférica o pared celular – capa exterior o glucocaliz (la estructura con la que se adhieren las plaquetas; gran avidez por proteinas externas/ interviene en la recepcion de estimulos => activacion); membrana celular, trilaminar: mantiene integridad celular (se encuentran: trombostenina de superficie, acido araquidónico y factor 3 plaquetario/f3p o tromboplastina plaquetaria); área submembranosa: finos filamentos; participa en formacion y estabilizacion de tentaculos (mantener la forma); 


2-sol-gel o hialoplasma (zona periferica del citoplasma); con microscopio electronico se observan en su interior 2 elementos fibrosos: haz marginal de microtúbulos (un anillo de microtubulos por debajo de la pared celular/ citoesqueleto de las plaquetas); microfilamentos (ubicados paralelamente a microtubulos; formados por proteínas contráctiles: actina, miosina, actomiosina o trombostenina, troponina y tropomiosina; intervienen en cambios de forma y secrecion de sustancias );

3-Zona de organelas – mitocondrias (deposito de ATP y de calcio); lisosomas (contienen enzimas hidroliticas que intervienen en la lisis celular); gránulos densos (son escasos y tienen una funcion secretora); gránulos específicos (sintetizados por aparato de Golgi, son los mas numerosos, engloban proteínas especificas : factor de von Willebran, f4p, betatromboglobulina, factor de crecimiento y proteínas no especificas: fibronectina, fibrinógeno) se vacían al exterior cuando se activan; masas de glucógeno (acumulo de esta);

4-Sistemas membranosos – aparato de Golgi; sistema tubular denso; sistema canalicular abierto;

Cinética plaquetaria – 2/3 partes de la masa plaquetaria circulan por la sangre y la 1/3 restante se deposita en el bazo con intercambio libre y bidireccional entre ellos; valor normal en la sangre 150.000 y 400.000; la vida media 8 – 12 días; destruidas en el hígado, bazo y sistema mononuclear fagocítico SMF o SRE;

Funciones de las plaquetas – hemostasia primaria mediante formación del trombo blanco plaquetario (3 fases: adhesión plaquetaria con la pared del vaso dañado, activación de los trombocitos y interaccion/agregación plaquetaria) y producción de algunos factores de la coagulacion.

1-Adhesión de las plaquetas (1-2 segundos)– tras la lesiones, se adhieren las plaquetas a los componentes internos de la pared vascular; al colágeno  rápida y irreversible, no precisa la presencia de proteina plasmatica/factor; a las microfibrillas y membrana basal requiere  calcio y factor de von Willebrand; el contacto entre trombocitos y la pared del vaso  liberación de adenosindifosfato (ADP) y desencadena su activación;

2-Activación de los trombocitos – al activarse  cambios morfológicos (metamorfosis viscosa): transformación de forma y aumento de seudópodos; alteraciones de la membrana: aumentan la tendencia de las plaquetas a pegarse entre si;  se estimula el sistema enzimática de síntesis de los trombocitos; desgranulacion: contraccion de microtubulos, acumulo de sus granulos en el centro  liberación a través del canalicular abierto de sus contenidos.

3-Agregación de las plaquetas – la activación  la unión de las plaquetas entre si (trombo blanco: inestable y reversible, se descompone si cesa el estimulo; puede ser irreversible y estable mediante la accion trombostenina plaquetaria;

Almacenamiento de producción de factores – sustancias que intervienen en la coagulación del plasma sanguíneo (factores plaquetarios de la coagulación):

-factor 1 plaquetario f1p: factor plasmático V que se encuentra en las plaquetas

-factor 2 plaquetario f2p

-factor 3 plaquetario f3p: la activación de vía intrínseca de coagulación junto a tromboplastina plaquetaria (factor III)  activación de protrombina  trombina

-factor 4 plaquetario f4p

-fibrinógeno o factor plasmático I de la coagulación (se encuentra en el plasma y pequeña parte en gránulos alfa de las plaquetas y su superficie)

-factor de von Willebrand: proteína plasmática (en parte se encuentra en gránulos alfa), contribuye a la adhesión y mantener niveles plasmáticos del factor VIII-C de la coagulación; factor VIII tiene 3 fracciones: 1.f.plaquetaria (f-vW) 2.f.coagulante (VIII-C) 3.f.antigenico pero sin efecto anticoagulante;

-factor plasmático V (FV): de síntesis hepática, 25% almacenado en los gránulos (f1p).

-factor plasmático XIII (F XIII): se encuentra 30-50% en las plaquetas

-trombostenina: proteína contráctil que interviene en la retracción de los agregados plaquetarios y del coagulo de fibrina.

Índices plaquetarios:

1-plaquetocrito PTC o PCT: relación entre el volumen ocupado por trombocitos y el ocupado por la sangre total en porcentaje; valor normal = 0,12 – 0,36%

2-volumen plaquetario medio VPM o MPV: valor medio del volumen de las plaquetas; valor normal = 7,2 – 11,1 fl (femtolitros)

3-anchura de la distribución plaquetaria PDW o índice de distribución de las plaquetas IDP: 

Valor normal = 25 – 65%; indica el grado de variabilidad existente entre los volúmenes de los trombocitos;

Práctica XXXIV (recuente de plaquetas en frotis sanguíneos)

Fundamento - determinación del numero de trombocitos presentes en 1 mm3 que ademas, permite el estudio de morfología de los trombocitos.
Material - para hacer frotis
Reactivo - tinción panóptico rápido
Muestra - frotis/ extensión de la sangre problema
Técnica - observar frotis con objetivo de inmersión del microscopio, contar el numero de plaquetas presentes en 4-5 campos microscópicos; al mismo tiempo, contar los hematíes hasta llegar a 1000; Comprueba el recuento con regla de 3: RBC (coulter) => Plq (coulter); RBC (frotis) => Plq (frotis); la proporción tiene que ser la misma o con un error de +/- 50.000 plaquetas.
Interpretación clínica - cuando el numero de plaquetas por mm3 de sangre es < a 150.000 => trombocitopenia o trombopenia o plaquetopenia; y cuando es > a 400.000 => trombocitosis (puede causar trombosis/embolia y necesitara tratamiento con heparina o dicumarino para mantener el fluidez); la clínica solo empieza si la cifra esta entre 50.000 - 80.000.

Práctica XXXV (recuento de plaquetas con hemocitómetro)
Fundamento - para el recuento de plaquetas en cámara, se diluye la sangre problema en un liquido apropiado y posteriormente, se deposita en la cámara de recuento, donde se cuentan las células presentes en algunos de los cuadrados de uno de los hematíes.
Material - cámara de Neubauer mejorado, tubo de ensayo, pipeta automática, cubreobjetos, microscopio, placa Petri y papel de filtro.
Reactivos - agua destilada; preparado de reactivo en tubo (normalmente están compuestos por oxalato amoniaco + azida sódica 0,2% que se utiliza como conservante)
Muestra - sangre venosa recogida en un tubo con EDTA
Técnica - al tubo reactivo (comercial) de 2 ml se añade 10 lambdas de sangre (1:200) o 20 lambdas de sangre (1:100); colocar la cámara de recuento cargada en el interior de una cámara húmeda para evitar que se seque la dilución en la cámara (placa Petri + un papel de filtro embebido en agua); dejar reposar 15 minutos (asegurar la sedimentación completa de todas las plaquetas); enfocar el cuadrado grande en el medio con el objetivo de 40x (se visualizan mejor con el condensador ligeramente bajo); contar la totalidad de los 5 cuadrados medianos; Comprueba el resultado del recuento con el resultado de coulter (+/- 50.000 margen de error)
Lectura - los trombocitos se observan como corpúsculos redondeados u ovalados, de tamaño muy pequeño y muy refringentes; para calcular el numero de plaquetas por mm3 de sangre: Plaquetas x 5 (total 25 cuadrados medianos) x Corrección de Volumen (10) x Corrección de Dilución (100 o 200)

ALTERACIONES DE LAS PLAQUETAS

Alteraciones morfológicas:

1-megatrombocitosis – plaquetas gigantes en la sangre periférica mas del 3%; indica la presencia de plaquetas inmaduras; se encuentra en: ausencia de bazo, púrpura trombocitopenica idiopática, síndromes mieloproliferativos, síndrome de Bernard –Soulier, enfermedad de May-Hegglin y síndrome de Chediak-Higashi.

2-microtrombocitosis – plaquetas pequeñas en la sangre periférica (trombocitos viejos);

3-Anisocitosis trombocitaria – distintos tamaños de plaquetas en la sangre periférica; frecuente e in-específica;
4-Hipogranulación trombocitaria - se observa citoplasma grisáceo y pobre en gránulos.

Artefactos plaquetarios:

1-superposición – deposito de una plaqueta sobre un eritrocito (se aprecia un halo alrededor de ella;

2-agregación – formación de acúmulos de plaquetas; se debe a ala presencia de aglutininas contra ellas (aglutininas dependientes del EDTA); se observa en los bordes de las extensiones sanguíneas; para diferenciar de una plaquetopenia, se realiza la prueba de triple extracción: dividir la sangre problema en 3 alícuotas y anticoagular la primera con EDTA, la segunda con citrato y la tercera con heparina;

3-satelitismo – adhesión de plaquetas a los neutrófilos; causas desconocidas

Alteraciones del número:

1-trombocitopenia, trombopenia o plaquetopenia – disminución de la concentración de las plaquetas por de bajo de 150.000 /mm3 por causas:

a.disminución de la trombopoyesis (pancitopenia, anemia mielotisica)

b.trombopoyesis ineficaz (trombopenias hereditarias / enfermedad de May-Hegglin, hemoglobinuria paroxística nocturna, déficit de acido fólico o de vitamina B12)

c.aumento de la destrucción de las plaquetas (púrpura trombocitopenica idiopática, púrpura trombotica trombocitopenica, secuestro esplénico / hiperesplenismo, infecciones sepsis, coagulación intravascular diseminada).

2-trombocitosis – aumento de la concentración de las plaquetas por encima de 400.000 /mm3 (400mil - 1 millón/mm3) por causas:

a.primarios/causas desconocidas (trombocitemia esencial, otros síndromes mieloproliferativos: LMC, policitemia vera)

b.secundarios de enfermedades (esplenectomia, infecciones con formación de depósito purulentos en empiema pleural, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, neoplasias malignas)

Alteraciones de la función (trombopatias):

1-hereditarias 

2-adquiridas 

PATOLOGIA TROMBOCITARIA

Trombopatias congenitas:

1-síndrome de Bernard-Soulier – trastorno genético muy infrecuente de un defecto de la adhesión de los trombocitos al subendotelio vascular; ausencia del factor de von Willebrand; alteración en la glucoproteina I que contiene acido sialico; cursa con hemorragias graves debido el tiempo de sangría alargado;

2-trombastenia de Glanzmann – enfermedad congénita de un defecto bioquímica de las plaquetas que da lugar a dificultad en la agregación de las plaquetas; a los enfermos no se produce la retracción del coagulo, la agregación esta disminuida y origina múltiples hemorragias; causas:

a.anomalia de las proteínas presentes en la membrana de los trombocitos (déficit de glucoproteina II, disminución en el fibrinógeno plaquetario o defecto en su capacidad funcional);

b.trastorno enzimática (disminución de la fosfogliceraldehido deshidrogenasa o de la piruvatocinasa);

Trombopenias:

1-púrpura trombocitopenica idiopática (PTI) – inmunotrombopenia (de la infancia o de la edad adulta) o enfermedad de Werlhof; PTI de la infancia aparece tras infección vírica, de una forma aguda y autolimitada (no requiere tratamiento); PTI del adulto causado por la acción de autoanticuerpos contra los trombocitos de forma crónica; manifestaciones clínicas: diátesis hemorrágica (<20.000), esplenomegalia, púrpura y petequias; los trombocitos no tienden a agruparse, son gigantes, citoplasma basófilo y pocos gránulos (inmaduros /la salida prematura de la medula ósea); en la MO los megacariocitos maduran con dificultad debido al ataque de los autoanticuerpos, con núcleo poco lobulado, citoplasma basófilo, poco granuloso y vacuolado (trombopoyesis ineficaz); tiempos de sangría y de retracción del coagulo alargados y la fragilidad capilar aumentada mediante la prueba de Rumple-Leede; se trata con: corticoides (prednisona), inmunosupresores, andrógenos sintéticos (danazol) y esplenectomia (para evitar el secuestro de las plaquetas sensibilizadas por los autoanticuerpos).

2-púrpura trombotica trombocitopenica PTT o síndrome hemolítico urémico – formación de trombos blandos de plaquetas-fibrina que obstruyen la luz de los vasos pequeños, da lugar a lesiones isquémicas que afecta los riñones y al sistema nervioso central; deposito endotelial trombohialino produce destrucción de glóbulos rojos, da lugar a anemia hemolítica microangiopatía; manifestaciones clínicas: fiebre, anemia, ictericia, hemorragias, uremia y signos neurológicos; trombocitopenia y datos de hemólisis (esquistocitosis, reticulocitosis etc.); en la MO proliferación reactiva de megacariocitos, hiperplasia eritroide; es mortal si no se trata con corticoides, antiagregantes plaquetarios (aspirina) y recambios plasmáticos.

Trombocitemia primaria o esencial (TE) – dentro de los síndromes mieloproliferativos, se de be a la expansión clonal de célula hematopoyética pluripotencial que afecta fundamentalmente a trombocitaria; estimulo idiopático de la trombopoyesis  híper producción de plaquetas anormales  grado variable de disfunción  destruidas por el bazo; manifestaciones clínicas: propensión a las hemorragias, trombosis, esplenomegalia, hepatomegalia; recuento de plaquetas 750.000 – 1.000.000 /mm3 y mayor; agregados de plaquetas, trombocitos gigantes y plaquetas hipogranulosas en las extensiones; en la MO se observa hiperplasia megacariocitica y gran liberación de plaquetas; se trata con fármacos mielosupresores (hidroxiurea 32P) y plaquetoferesis.

GENERALIDADES SOBRE LA HEMOSTASIA

Hemostasia: hemo = sangre y stasis = parada (conjunto de mecanismo que el organismo pone en marcha para cohibir las hemorragias); es una reacción en cadena/cascada de coagulación (un factor activa al otro); 3 componentes: tisulares (vasos sanguíneos y factores tisulares de la coagulación/tromboplastina tisular), plaquetarios (trombocitos y factores plaquetarios), plasmáticos (factores que activan o inhiben la coagulación y fibrinolisis).

Fases:1-hemostasia primaria (dura 3-5 minutos): lesión vascular  vasoconstricción refleja (enlentecimiento de la circulación de la sangre)  las plaquetas se trasladan desde el centro hacia la periferia del vaso y reactivan sustancias serotonina / 5-hidroxitriptamina (vasoconstrictoras)  los trombocitos se adhieren al subendotelio vascular + agregarse entre si  trombo blanco plaquetario (hemostasia provisional para una ruptura pequeña); si la lesión es mayor: el trombo blanco + red de fibrina  se consolida y es capaz de parar la hemorragia definitivamente;

2-coagulación (dura 5-10 minutos desde el momento de la lesión) – es el proceso que conduce a un cambio en el estado físico del plasma (gelificacion): transformación de fibrinógeno (proteína soluble)  fibrina (insoluble, en forma de red que consolida el agregado plaquetario)  coagulo (el punto final de una reacción en cadena/ activación sucesivas de un factor a otro mediante un proceso de retroalimentacion; interrelacion entre vias intrinseca y extrínseca de coagulacion que se puede ser activada o inhibida a distintos niveles por el organismo trombo sanguíneo: un coagulo de sangre adherido a la pared de un vaso; embolo sanguíneo: un trombo desprendido de la pared vascular y arrastrado por la corriente sanguínea; las sustancias intervenidos en esta fase  factores de la coagulación;

3-fibrinolisis (dura 2-3 días) – el proceso de la disolución del coagulo de fibrina, después de que este ha cumplido su función hemostática => destrucción de la fibrina (degradación enzimática mediante plasmina); finalidad: permite un libre transito de la sangre; durante el tiempo que transcurre, se produce una reparación de la integridad vascular/ angiogénesis => la rotura/lesión  estimulo angiogenico  migración y proliferación de las células endotelias, mitosis (neovascularizacion): producción de proteasas y movimientos quimiotácticos;

Queloides: factor genético de mal curación de la cicatriz  se forma un bulto.

FACTORES DE LA COAGULACIÓN

F. Activadores de la Coagulación – estimulan el proceso de la coagulación o constituyen el soporte estructural de esta; se nombran con números romanos o con su nombre propio o de la persona que lo descubrió y letra "a" minúscula cuando esta activado clasificación:

1-según su naturaleza química: proteicos (glucoproteina, la mayoría), lipídicos (tromboplastina tisular, f3p) y metálicos (el ion calcio o Ca++).

2-según su procedencia donde son sintetizados:

a-tisulares (tromboplastina tisular, colágeno y parte de factor VIII);

b-plaquetarios (un grupo menor: f3p);

c-plasmáticos (la mayor parte: el factor VII, el IX, el X, el XI, el XII, el XIII, la precalicreina y el quininogeno de alto peso molecular);

d-hepáticos (muchos de los factores plasmáticos se sintetizan en el hígado: el factor I, el II, el V el VII, el VIII-C, el IX, el X, el XI, el LXIII, la PK y HMWK).
algunos son producidos en 2 lugares (f-VIII) o no se conoce con total seguridad el lugar de su síntesis (f-XII)

3-según las influencias a las que son sensibles:

a-los factores vitamina K dependientes: el factor II, el VII, el IX y el X (aminoácido) sirve para fijar el Ca++ durante el proceso del coagulo; estos factores pierden su actividad en el déficit de vitamina K o hay acción antagonista de los anticoagulantes orales; vitamina K obtenida de los vegetales y de las bacterias intestinales;

b-los factores sensibles a la trombina: el factor I, el II, el V, el VII, el VIII y el XIII) activados directamente por la trombina;

4-según su función:

a-los factores desencadenantes (tromboplastina tisular y f3p) – ponen en marcha a alguna de las vías de la coagulación  fijando sobre su superficie a otros factores activadores para que no se diseminen y alcancen la lesión vascular en una concentración que sobrepase la acción de los factores inhibidores;

b-los factores de contacto (el factor XI, el XII, la precalicreina y el quininogeno de alto peso molecular) – solo actúan en el inicio de la vía intrínseca y en el proceso de la fibrinolisis; necesitan Ca++ para ejercer su acción;

c-los factores enzimáticos (muchos son serinproteasas) – necesitan un cofactor metálico (Ca++) u orgánico (factor V, VIII y quininogeno de alto peso molecular) para desarrollar su acción;

d-el único factor estructural es el fibrinógeno – capaz de al fraccionarse, dar lugar al coagula de fibrina.

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Factor I o Fibrinógeno – glucoproteina (3-5% de hidratos de carbono y 3 pares cadenas polipeptídicas: A alfa, B beta y gamma – A alfa y B beta son atacadas por trombina y gamma - resistentes); se encuentra la mayor parte en el plasma Fpm (el suero carece de fibrinógeno), es de síntesis hepática ; la minoría en la superficie y intraplaquetario (FIPq) formados por los megacariocitos; su vida media es de 4-6 días; mecanismo: trombina + cadenas A alfa y B beta del fibrinógeno  se desprende fibrinopeptido A + fibrinopeptido B  fibrinógeno de cadenas peptidicas alfa, beta y gamma  monómeros de fibrina  se polimeriza forman la estructura del coagulo; reptilasa (venenos de serpientes) también hidrolizar el fibrinógeno  inducir la coagulación; la concentración de fibrinógeno en el plasma 150-450 mg/dl, disminuye en: hepatopatias graves, coagulación intravascular diseminada; aumenta en: embarazo, enfermedades autoinmunes, inflamaciones (como reactante de fase aguda).

Factor II o Protrombina/ PT – glucoproteina (10% de hidratos de carbono y 1 cadena polipeptídica); se encuentra en el plasma y ausente en el suero, su vida media es 4-6 días; es de síntesis hepática y vitamina K dependiente; activada por protrombinasa (fXa, fVa + Ca++)  trombina (T): serinproteasa que hidroliza la molécula de fibrinógeno, protrombina y activa los factores V, VII, VIII y XIII; ademas, facilita agregación trombocitaria; la trombina es inhibida por el fibrinopeptido A, liberado en la hidrólisis del fibrinógeno y por las antitrombina; mal función de protrombina por déficit de vitamina K (mala absorción o obstrucción biliar o terapia de antagonistas dicumarinos/sintron).

Factor III o tromboplastina tisular o histica /TH y el f3p – f3p es un fosfolípidos acido y TH es una lipoproteína (la porción lipídica constituida por fosfolípidos); f3p ubicado en la membrana de las plaquetas, tromboplastina tisular se encuentra en el tejido: vascular, renal, hepático, pulmonar, cerebral, placentario; se libera al plasma cuando hay una rotura de los vasos; f3p interviene en la vía intrínseca en activar factor IX (junto con el factor XIa y el Ca++) y en la activación factor X (junto con el factor IXa, el VIIIa y el Ca++); TH interviene en la vía extrínseca en activar factor X (junto con el factor VIIa y el Ca++) también puede intervenir en la activación del factor IX; el factor III interviene junto con la protrombinasa en la activación de la protrombina.

Factor IV o calcio iónico (Ca++) – 50% de la cantidad del calcio presente en la sangre; los anticoagulantes realizan su función debido a su acción quelante del calcio (oxalato sódico, citrato sódico y EDTA); Factor IV interviene como cofactor en las etapas de la coagulación; solo se necesita poca cantidad de Ca++ para la coagulación (no causa hemorragias en hipocalcemia).

Factor V o factor labil o proacelerina – glucoproteina en el plasma y ausente en el suero (25% almacenado en los gránulos plaquetarios); es de síntesis hepática, activado por la trombina, su vida media es de 12-20 horas; es cofactor y forma parte de la protrombinasa en activar protrombina; el factor Va es inhibido por la proteína C; disminuido en pacientes con hepatopatia grave.

Factor VI es el factor V activado (no existe!!)

Factor VII o factor estable o proconvertina – glucoproteina de cadena única, se encuentra en el plasma y suero, sintetizada por el hígado y células renales; su vida media es de 4-6 horas/tiempo de Quick; es vitamina K dependiente; activado por la trombina y por el factor Xa, IXa y XIIa; activada como serinproteasa e interviene en la vía extrínseca activando el factor X junto con la tromboplastina tisular y el Ca++; ademas juntos pueden activar factor IX; el factor VIIa es inhibido por la AT III; su concentración aumenta en las mujeres que toman anovulatorios de estrógenos y embarazadas.

Factor VIII o antihemofílico A – glucoproteina en el plasma (ausente en el suero);2 fracciones: F.VIII-vW (inductora de la adhesión de las plaquetas) o de von Willebrand, fabricada por las células endotelias de los vasos y por los megacariocitos y F-VIII-C, mas pequeña (capacidad coagulante), sintetizado en el hígado; activado por la trombina, la fracción VIII-C  cofactor en la vía intrínseca (la activación del factor X por el factor IXa, el Ca++ y el f3p; la fracción VIII-vW (4 funciones)  1).facilita la agregación de los trombocitos, 2).contribuye a la adhesión de las plaquetas, 3).ayuda a mantener niveles plasmáticos de la fracción VIII-C, 4).protege la fracción VIII-C que no sea inactivada por enzimas proteo líticas. El déficit de la fracción VIII-C causa hemofilia A o clásica, y el déficit de VIII-vW, origina la enfermedad de von Willebrand; aumenta en las mujeres que toman anovulatorios (sufre trombosis) y las embarazadas.

Factor IX o Christmas o antihemofílico B – glucoproteina que se encuentra en el plasma y suero; es de sintetiza hepática y es vitamina K dependiente; activado por la vía intrínseca por el factor XIa, Ca++ y f3p y por la vía extrínseca por el factor X, VIIa, el Ca++ y la TH; activado como serinproteasa e interviene en la vía intrínseca en la activación del factor X junto con el factor VIII-Ca, el Ca++ y el f3p; el factor IXa es inhibido por la AT III; déficit del factor IX produce la hemofilia B o enfermedad de Christmas; la concentración aumenta en las embarazadas.

Factor X o de Stuart-Prower – glucoproteina que se encuentra en plasma y suero; sintetizado por el hígado y es vitamina K dependiente; activado por la vía intrínseca por los factores IXa, VIII-Ca, Ca++ y f3p o por la vía extrínseca por los factores VIIa, Ca++ y TH; activado como serinproteasa y forma parte de la protrombinasa que activa la protrombina; el factor Xa es inhibido por la AT III y por la alfa2-antiplasmina; aumentada en las mujeres que toman anovulatorios y las embarazadas.

Factor XI o antecedente plasmático de la tromboplastina – glucoproteina, se encuentra en el plasma y suero; es de síntesis hepática y el factor de contacto; se activa por el factor XIIa junto con el quininogeno de alto peso molecular; activado como serinproteasa e interviene en la vía intrínseca al activar el factor IX junto con Ca++ y f3p; el factor Xia es inhibido por la AT III, la alfa1-antitripsina y el C1 inhibidor; desciende durante el embarazo y origina enfermedad hemorrágica en su déficit.

Factor XII o Hageman – glucoproteina, se encuentra en el plasma y suero; es de síntesis desconocido y es factor de contacto; activado en 2 maneras: por el contacto con superficies de cargas eléctricas negativas (cristal, colágeno y ácidos grasos) y por la acción proteolitica de enzimas (tripsina, plasmina y calicreina); activada como serinproteasa y es capas de activar (junto con el quininogeno de alto peso molecular): al factor XI y a la precalicreina; XIIa es inhibido por la AT III y el C1 inhibidor.

Factor XIII o estabilizante de la fibrina – glucoproteina, se encuentra en el plasma y suero; es sintetizado por el hígado y los megacariocitos; 30-50% se ubica en las plaquetas; activado por la trombina en presencia de Ca++  actúa sobre los polímeros de fibrina, estabilizando el coagulo de fibrina lo hace mas insoluble y resistente a la acción destructora de la plasmina.

Precalicreina (PK) o factor Fletcher – glucoproteina, se encuentra en el plasma y el suero; es de síntesis hepática y es un factor de contacto; activado por el factor XIIa, el quininogeno de alto peso molecular; activado como calicreina, es serinproteasa que activa factor XII y inhibida por la alfa2-macroglobulina, la alfa2-antiplasmina y el C1 inhibidor.

Quininogeno de alto peso molecular (HMWK) o factor Fitzgerald – glucoproteina, se encuentra en el plasma y suero; es de síntesis hepática y es un factor de contacto; como cofactor en la activación del factor XI de la precalicreina

Factores inhibidores de la coagulación – mantener el equilibrio de la coagulación; el grado de extensión de la coagulación es una confluencia entre los mecanismos de activación y inhibición que actúan obre ella; la coagulación se limita a la zona vascular lesionada como consecuencia de 2 mecanismos: 1).capacidad diluidora del flujo normal de sangre => conduce las formas activadas de los factores de la coagulación circulen hasta el hígado para ser destruidas; 2).la presencia en el plasma de sustancias inhibidoras que neutralizan las formas activadas.

Proteína C – proteína plasmática de síntesis hepática y es vitamina K dependiente; circulan como cimógeno/precursor inactivo que se activa por la trombina;

Proteína S – proteína plasmática de síntesis hepática y vitamina K dependiente; puede que funcione como cofactor de la proteína C.

Antitrombina III (AT III) – glucoproteica plasmática; inactiva a la trombina y los factores VIIa, IXa, Xa, XIa y XIIa; antitrombina mas potente; la heparina actúa como cofactor de la AT III (potencia su función inhibidora); su déficit congénito origina tromboticos;

Alfa2-macroglobulina – glucoproteina que inactiva a la trombina y a la calicreina.

Alfa1-antitripsina – inhibe a la trombina, la calicreina y factor XIa.

Alfa2-antiplasmina – inactiva a la trombina, a la calicreina y al factor Xa.

C1 inhibidor 

Inhibidores patológicos – aparecen en determinadas patologías

DINÁMICA DE LA COAGULACIÓN

Vías no comunes – intrínseca o endógena: un sistema exclusivamente sanguíneo; extrínseca o exógena: requiere intervención de sustancias procoagulantes procedentes de los tejidos dañados + factor tisulares; ambas vías pueden desarrollarse a la vez y se interrelación entre ellas;

Vía Intrínseca:

1. Activación del factor XII – 1er fase => contacto con cargas eléctricas negativas (colágeno o vidrio)  f XII  se hace + sensible a la acción proteolítica posterior; 2nd fase  f XII pre-activado + K => fXIIa +  PK con ayuda de HMWK  K (se activan entre si).

2. Activación del factor XI – se activa por la acción proteolitica del fXIIa + colaboración del quininogeno de alto peso molecular (HMWK)  fXIa.

3. Activación del factor IX – debido a la acción proteolitica del factor XIa + colaboración del Ca++ y del f3p f IXa.

4. Activación del factor X – por la vía intrínseca, debido a la acción proteolitica del factor IXa + colaboración del factor VIII-Ca, del Ca++ y del f3p  fXa; f VIII-C se activa por la trombina  fVIII-Ca (su función es del cofactor).

Vía Extrínseca:

1. Activación del factor VII – fVII se activa por la acción de la TH al dañarse los tejidos, también puede ser activado por la acción proteolotica del f Xa o de la trombina  fVIIa.

2. Activación del factor X – por la vía extrínseca debido la acción proteolitica del factor VIIa + colaboración del Ca++ y TH (tromboplastina tisular)  fXa.

Interrelaciones entre las dos vías (una de ellas puede intervenir en la activación de la otra) fXIIa y IXa puede activar fVII y fVIIa con la colaboración de Ca++ y TH, puede activar al fIX.

Vía común:

1-formación de trombina: protrombinasa (la unión entre factor Va, Ca++, fXa) fijada sobre fIII (TH+f3p) activa a protrombina (fII)  trombina + factor V  fVa (activación en circulo); fVa es cofactor del factor proteolítico Xa

2-formación del coagulo de fibrina:

a-degradación del fibrinógeno por la trombina rompe las cadenas Aalfa, Bbeta de fibrinógeno  se desprenden fibrinopeptidos A y B  monómeros de fibrina (cadenas peptídicas alfa+beta+gamma).

b-polimerización de los monómeros de fibrina  formación de enlaces de hidrogeno entre los monómeros  cordones/red de fibrina o coagulo (soluble-reversible).

c-estabilización de la fibrina – llevada a cabo por el factor XIIIa  estabiliza el coagulo de fibrina (lo hace mas insoluble y resistente a la plasmina); fXIII es activado por la trombina con la colaboración de Ca++ y también fibrinógeno como cofactor.

d-retracción del coagulo: coagulo estabilizado de fibrina + trombostenina plaquetaria (proteina contráctil)  coagulo retraído  engloba células sanguíneas + exudación de suero.

Fibrinolisis

Fibrinolisis – destrucción del coagulo de fibrina es llevada a cabo por plasmina que es formada por la activación del plasminógeno; se produce tras la reparación de la pared del vaso dañado para la reanulación del flujo sanguíneo a través de la luz vascular; permite la disolución de los depósitos de fibrina que pueden aparecer espontáneamente y repermeabilizacion de los vasos trombosados; los restos que quedan tras la fibrinolisis son captados por macrófagos; 

Factores activadores del plasminógeno (PA):

Endogenos – fXIIa, K , HMWK, fIIa, proteína C, activador tisular Atp, uroquinasa y la trombina; factores plasmáticos; las células endoteliales vasculares producen un activador del plasminógeno (proteína C); los tejidos uterino, prostático, pulmonar, cardíaco y renal produce una proteasa (AtP – activador tisular); la orina humana normal contiene un potente activador (urocinasa o uroquinasa) que se emplea en tratamiento de trombosis y embolia pulmonar.

Exógenos – bacterianos (estreptocinasa o estreptoquinasa) producidas por estreptococos b-hemolíticos y estafilocinasa, Varidasa – empleado para procesos inflamatorios con hematoma.

Plasminógeno (PLG) – proteína de cadena única, se encuentra en plasma y suero, de síntesis hepática; transformado en plasmina (irreversible) por los activadores del plasminógeno /PA.

Plasmina – proteína de dos cadenas, es serinproteasa, actúa sobre la fibrina y degrada fibrinógeno  productos de degradación del fibrinógeno/fibrina (PDF); también degrada fV, FVII y fVIII y al complemento; retirada de la circulación por SRE (macrófagos).

Factores inhibidores (antifibrinolisis): actúa contra los activadores del plasminógeno y contra plasmina; alfa1-antitripsina, alfa2-macroglobulina y alfa2-anti-plasmina;

Actuación de la plasmina sobre la fibrina y fibrinógeno – destruir los coágulos de fibrina y fibrinógeno nativo; 3 fases: 1) actúa sobre la cadena gamma fragmentos X (todavía capaces de coagularse) + pequeños péptidos; 2) actúa sobre las cadenas A,B y gama: plasmina + fragmentos X  fragmentos D e Y (ya no son capaces de coagularse); 3) actúa sobre las cadenas alfa, beta y gamma: plasmina + fragmentos Y  fragmentos E y nuevos fragmentos D;

productos de degradación del fibrinógeno/fibrina PDF => son fragmentos originados en esta destrucción que ejerce un efecto antihemostático => inhiben la polimerización de los monómeros de fibrina, inhiben la agregación plaquetaria (trombo blanco) y ademas, una función antitrombínica (inhibe la activación/ formación de trombina); los PDF X e Y se llaman PDF precoces / de alto peso molécula; PDF D y E se denominan PDF tardío / bajo peso molecular;

Actuación de plasmina sobre otros factores - como una enzima poco especifica, también ataca a otros factores de la coagulación

GENERALIDADES SOBRE LAS PRUEBAS DE HEMOSTASIA

Toma de muestra – preparación del paciente: estar en ayunas o al menos no haber ingerido alimentos grasos en las horas inmediatamente precedentes a la extraccion (plasmas lipémicos da problema a la detección fotométrica del coagulo);

Extracción de la muestra: 1. con menor estasis circulatorio posible (el tiempo de tener el smarch puesto) 2. daño mínimo a los tejidos circundantes para no contaminar la sangre con tromboplastina tisular 3. rechazar los primeros ml de sangre extraídos de los restos de tromboplastina tisular (echar el primer tubo de extracción múltiple con vacío interno Venoject o Vacutainer); no insertar primero el tubo destinado a la recogida de sangre para pruebas de hemostasia.

Anticoagulación de la muestra: sustancia elegida es citrato trisódico 3,8% (1:9 para pruebas de coagulación y 1:4 para VSG)  conserva mejor los factores de la coagulación; mezclar inmediatamente con movimiento de suave inversión => evitar formación de espuma y rotura de hematíes (ricos en tromboplastina tisular); se mezcla 1 parte de citrato trisódico con 9 partes de sangre venosa;

Procesamiento de la muestra: en algunas ocasiones, se procesa la sangre anti-coagulada con la aspiración de obtener un plasma carente de algunos factores.

Obtención de Plasma Rico en Plaqueta (PRP): mediante centrifugación suave 1000 rpm durante 10 minutos, se retira el sobrenadante rápidamente del resto y se transfiere a un tubo adecuado  estudio plaquetarios (hay + plaquetas).

Obtención de plasma Pobre en Plaquetas (PPP): mediante centrifugación intensa de 3.000 rpm durante 10 minutos; se retira el sobrenadante rápidamente del resto y se transfiere a un tubo adecuado  pruebas de coagulación.

Obtención de suero: la sangre no anticoagulada se extrae en un tubo especial de sistemas Vacutainer y Venoject (tubo amarillo), se deja coagular a temperatura ambiente durante 5-10 minutos, centrifugar el tubo a 3.000 rpm – 10 minutos; decantar el sobrenadante (el suero) con pipeta Pasteur; 

Conservación de la muestra: se procesa lo antes posible (menos de 30 minutos desde la extracción); si se retrasa se conserva en la nevera a 5º para evitar la perdida de factores; el plasma conseguida debe ser utilizado antes de 4 primeras horas desde la extracción; si se retrasa, se conserva a 5º durante 12 horas o durante 1 mes a -20º.

Coagulómetro:
- la mezcla de plasma+reactivos en temperatura optima de reacción, se deposita en una cubeta de coagulómetro con un trocito de acero;
- la cubeta situada entre un diodo emisor de luz ultravioleta y un fotodetector;
- cuando se añade a la mezcla el reactivo desencadenante (cloruro cálcico), se pone en marcha un magnetoagitador y comienza la lectura;
- el magnetoagitador provoca la rotación del trocito de acero, que impide la sedimentación de los reactivos, facilita el mezclado homogéneo de la mezcla, y posibilita un posicionamiento perfecto del coagulo en el paso óptico del fotodetector;
- a medida que aumenta la opacidad de la mezcla, llega menos luz al fotodetector y, por lo tanto, disminuye la tensión de salida de este;
- la tensión analógica de salida del fotodetector es amplificada y transformada, por un convertidor analógico digital, en señales digitales que son recogidas por un microprocesador;
- al formarse el coagulo de fibrina, la opacidad de la mezcla se incrementa bruscamente y la reducción en las señales que llegan al microprocesador hace que este finalice la lectura y pare el cronometro;
- el dato de tiempo registrado por el cronometro es ofrecido al analista en una pantalla o/y es imprimido
- los coagulómetro consta de una placa calefactora que puede ser utilizada para realizar las incubaciones necesarias para la ejecución de estas pruebas;

Pruebas que investigan la hemostasia primaria

Pruebas que estudian la fragilidad vascular:

Prueba de Rumpel-Leede – evaluar la resistencia que ofrecen las paredes capilares al aumento de la presión intra capilar y a la anoxia  se traza un circulo de unos 5 cm de diámetro y se marca los puntos que se puede confundir con el resultado en la cara anterior del antebrazo y se traza un circulo a  cm de la flexión del codo; se aplica un esfigmomanometro en un brazo con la presión media de la tensión arterial, durante 5 minutos; esto origina un incremento en la presión intracapilar y una anoxia responsables de la producción de extravasaciones sanguíneas  visibles en forma de petequias (puntitos rojos que no se van al presionar la zona); resultado dudoso entre 10-20 petequias y se considera positiva => mas de 20 petequias en la cara anterior del antebrazo; ascenso de la fragilidad capilar en trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand y las púrpuras vasculares.

Pruebas que estudian la funcionalidad plaquetaria:

1.Prueba de retracción del coagulo – capacidad de retracción del coagulo depende de la aptitud de las plaquetas para liberar trombostenina => situar 2 ml de sangre no anti-coagulada en un tubo de vidrio graduado; se espera a que coagula la sangre, dejándola a 37ºC durante 1 hora / temperatura ambiente durante 3 horas; normalmente el coagulo comienza a retraerse desde la 1ª hora, pero sigue siendo soluble durante las primeras 3-4 horas; se valora la adherencia del coagulo formando a las paredes del tubo (al retraerse, queda adherido y fundamentalmente, a nivel de su extremo superior)  y el volumen de suero exprimido del coagulo durante la retracción de este (equivale aproximadamente a la mitad del volumen inicial de sangre); el sedimento de hematíes expulsados del coagulo, presente en el fondo del tubo, es escaso (< 5 mm de grosor).

2.Tiempo de hemorragia o de sangría (TS) – el tiempo que transcurre desde la sección de un grupo de capilares hasta la formación del trombo blanco plaquetario e indica la capacidad constrictora de los capilares y el numero aptitud adherente y agregante de las plaquetas =>  se determina efectuando una pequeña herida en la piel (una punción con una lanceta en el lóbulo de la oreja/técnica de Duke o un par de cortes en el antebrazo con un aparato especial /técnica de Ivy que es mas exacta que de Duke) y seguidamente poner en marcha el cronometro, midiendo el tiempo (cada 30 segundos) que tarda en cesar de manar sangre a través de esa herida (recogiendo las gotas de sangre con un papel de filtro sin presionar la herida); el tiempo de hemorragia normal con técnica de Duke 3-5 minutos y con técnica de Ivy 1-7 minutos; ;TS alargado en trombocitopenia, trombopatias congénitas, enfermedad de von Willebrand y sujetos que toman aspirina.


Tiempo de hemorragia (técnica de Ivy) - colocar el esfigmomanometro en el brazo del paciente a 40 mmHg, mantenemos así durante toda la prueba; limpiamos con alcohol la cara del antebrazo; con una lanceta hacer 3 punciones separadas de 3 mm de largo por 3 mm de profundidad; ponemos en marcha el cronometro y cada 30 segundos recogemos la sangre con el papel de filtro hasta que todas las punciones dejen de sangrar; interpretación clínica = técnica de Duke.

PRUEBAS QUE INVESTIGAN LA COAGULACION

Pruebas que estudian globalmente la coagulación:

Tiempo de coagulación (tiempo de Lee White) – el tiempo que tarda en generarse un coagulo en una muestra de sangre no anticoagulada, que se pone en contacto con una superficie de vidrio; permite detectar los trastornos relacionados con la vía intrínseca o con la vía común de la coagulación => se sitúa la muestra 2 ml en el tubo de ensayo y se incuba a 37ºC (tiempo de coagulación transcurre desde el deposito de la sangre en el tubo hasta la aparición de un coagulo en el interior del mismo); el tiempo de coagulación depende varios factores (el volumen de muestra y la superficie del tubo); VN 5-12 minutos; el tiempo es aumentado en déficit de factores de via intrínseca (hemofilia), afibrinogenemia y fibrinolisis excesiva y terapias con heparina; esta prueba es poco sensible, ya que no detecta déficit ligeros de factores por lo que esta en desuso.

Pruebas que estudian la vía intrínseca:

1.Tiempo de tromboplastina parcial (TTP/PTT) – o tiempo cefalina: el tiempo que se necesita para que coagule un PPP tras su recalcificación (adición de cloruro cálcico/CaCl2) y en presencia de un sustituto del f3p (suspensión de fosfolípidos obtenida de cerebros de conejos/cefalina que vienen liofilizados); la adición de cefalina evita que el tiempo que tarda en generarse el coagulo de fibrina depende del numero de plaquetas que están presentes en el plasma (para que no intervengan las plaquetas y solo los factores de la vía intrínseca).

2.Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA/APTT) – similar que TTP, pero además, incorpora una sustancia activadora de los factores de contacto (es más rápida que PTT); como activador de los factores de contacto se pueden utilizar varias sustancias, pero lo que usamos es ácido elágico; VN de APTT 30-40 segundos; también se puede expresar su resultado en forma de relación o cociente entre el umero de segundos que tarda en coagular el plasma del paciente y el numero de segundos que tarda en coagular un plasma CN; cuanto mas alto es este cociente,mayor es el déficit coagulatorio => Tpaciente/Tcontrol normal = tendencia de hipo/hiper coagulabilidad; VN de ratio APTT 1-1,2 (>1,2 es falta de coagulabilidad); tanto PTT como APTT sirven para explorar el estado de la vía intrínseca y de la vía común de la coagulación y permiten detectar déficit de los factores que intervienen en ellas y para el control de los tratamientos con anti-coagulantes, en concreto con heparina.

Pruebas que estudian la vía extrínseca

Tiempo de protrombina (TP/PT) – tiempo de Quick: el tiempo que tarda en coagular un PPP cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hística; sirve para explorar el estado de la vía común y sobre todo vía extrínseca de la coagulación (fII, fV, fVII y fX); se emplea para (1) detectar el déficit de factores de la vía extrínseca (2) para el control de pacientes sometidos a terapias con dicumarinas (3) para la vigilancia de la evolución de enfermos con algunos trastornos hepáticos; TH se prepara a base de extractos de cerebro o de pulmón de hombre o de animales (conejo o vaca); TH fabricadas no tienen la misma sensibilidad, por lo que hay que comparar con TH de referencia internacional => ISI (indice de sensibilidad internacional = 1,0) cuanto mas cercano a ISI, mayor es su concordancia con el patrón primario; el reactivo que se utiliza es una mezcla de TH y de Ca => tromboplastina cálcica; VN de PT: 11-13 segundos (corresponde al 70-100% de actividad); los resultados también se expresa en % de actividad (indice de Quick); por ello se prepara una batería de diluciones a partir de un plasma CN y se mide el PT del plasma CN no diluido/puro (100%) y de cada una de las diluciones preparadas (con sus correspondiente %); con los datos obtenidos, se traza una curva de calibrado (curva de actividad de la protrombina) anotando en el eje de ordenadas los valores en segundos del PT del plasma CN no diluido + cada una de sus diluciones y en el eje de abscisas, el % de actividad asignado a cada uno de ellos; finalmente el valor en segundos del PT del plasma problema,se interpola en la gráfica y se halla el porcentaje de actividad de la protrombina que le corresponde a este; los resultados se pueden expresar en forma de proporción (ratio) entre valor en segundos del PT plasma problema y del PT plasma CN no diluido; en un control de anti-coagulación, se calcula el cociente corregido con el ISI para evitar el error que implica el uso de diferentes TH; el cociente corregido permite relacionar los resultados obtenidos con distintos reactivos comerciales (INR-international normalized ratio) se calcula:
INR  =  (TP del plasma de paciente)  isi      

              (TP del plasma CN)
la ratio de protrombina normal: 0,9 y 1,15
Un correcto tratamiento con anti-coagulante orales (anti-vitaminas K o dicumarinas), INR debe fluctuar entre 1,5 y 4,5; el paciente con < 1,5 => escasamente anti-coagulado y el paciente > 4,5 =>  excesivamente anti-coagulado

Pruebas que estudian la vía común

Cuantificación de fibrinógeno – el tiempo que tarda en originarse el coagulo de fibrina depende, exclusivamente de la cantidad inicial de fibrinógeno y es inversamente proporcional a la concentración de esta en la muestra; sirve para explorar ademas de vía común, la fase de la fibrinolisis; son pruebas caras, sensible, que deben hacerse en laboratorio específicos (de inmunológia); el fibrinógeno plasmático se cuantifica mediante diferentes métodos; actualmente solo se usan aquellos que exploran sus capacidades antigénicas; se basan en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar el fibrinógeno presente en PPP diluido a fibrina  => formar coagulo; la trombina empleada esta a una concentración muy alta (100 U NIH/ml) => poco o nada influenciadas por los inhibidores de ese factor (plasmina); los métodos inmunológicos => detectar la presencia en el plasma, del fibrinógeno, mediante Acs dirigidos contra el; VN de fibrinógeno en el plasma (fibrinogenemia) : 150-450 mg/dl; disminuida => trastornos congénitos (afibrinogenemia congénita) o adquiridos (hepatopatías); aumentada => procesos inflamatorios (inespecíficos) por ser reactante de fase aguda y en estrés, embarazo y tto anovulatorios; métodos inmunológicos => determinan la concentración normal de fibrinógeno plasmáticos; métodos funcionales => determinan la concentración anormalmente baja de fibrinógeno plasmático, ya que una parte es incapaz de degradarse con normalidad.

Practica - Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (TTPA/APTT)

Fundamento - APTT es el tiempo que tarda en coagular un PPP tras su recalcificación y e presencia de un sustituto de f3p y de un activador de los factores de contacto (el ácido elágico) => se realiza mediante la adición de cloruro cálcico (Ca Cl2); el sustituto del f3p es una suspensión de fosfolípidos obtenida a partir de cerebros de conejos (cefalina); se añade con la cefalina un factor de contacto el ácido elágico;
Material necesario - gradilla, 3 cubetas o pocillos de coagulómetro, trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas, rotulador de vidrio de punta afina, pipeta automática 100 lambdas, puntas de pipeta automática adecuada, coagulómetro, baño maría 37ºC, tubos de ensayo de plástico.
Reactivos - solución de cloruro cálcico y cefalina activada de casa grifols, plasma CN; reactivo que se necesita: cefalina activada y cloruro cálcico (CaCl2) 100 lambdas (cada reactivo) x 3 cubetas;
Muestra - PPP correctamente preparado

Técnica - homogeneizar los reactivos y la muestra suavemente; depositar el volumen total que se va a necesitar de cada uno de los reactivos y el de la muestra en tubos de ensayo de plástico, adecuadamente rotulados; atemperar los reactivos y la muestra a 37º 5-15 minutos; introducir un trocito de acero en 3 cubetas del coagulómetro (CN,CP y M); rotular el extremo superior de una cubeta del coagulómetro con letra M, CN, CP; verter 100 lambdas de muestras en cada cubeta anterior, añadir 100 lambdas a lo anterior de cefalina activada (cefalina+ ácido elágico); mezclar bien el contenido de cada cubeta; incubar la mezcla a 37ºC durante 3 minutos en la placa calefactora del coagulómetro; colocar uno por uno de las 3 cubetas en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 100 lambdas de CaCl2; al agregar el CaCl2, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de este; cuando se forma el coagulo, el coagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición del CaCl2.

Lectura de resultados - APTT es el tiempo transcurrido desde la adición del CaCl2 hasta la formación del coagulo de fibrina; VN de APTT 30-40/45 segundos y para pacientes que toman dicumarinos 1,5-2 veces mas que VN; se considera anormal APTT de la muestra superior en mas de 8 segundos al del CN; APTT en forma de cociente o proporción (ratio) entre el tiempo de paciente y el tiempo de CN => 1-1,2; cuanto mas alto es este cociente, mayor es el déficit coagulatorio.

Interpretación clínica - cuando APTT elevado se asocia a un tiempo de Quick normal (o como mucho ligeramente alterado), estaremos ante un déficit de uno de los factores de la vía intrínseca de VIII / IX o bien ante un tratamiento con heparina; Hay que recordar que la actividad anti-coagulante de la heparina se debe a que al unirse como cofactor de la anti-trombina III (ATIII) inhiben a la trombina y a los factores IX, X, XI, XII plasmina y Calicreina ademas de interferir en la actividad plaquetaria; por tanto, solo se vera afectada la vía intrínseca y la común, pero no la vía extrínseca; cuando APTT elevado se asocia a un Quick también elevado, pensaremos en la posibilidad de una insuficiencia hepática, coagulopatia de consumo (coagulacion intravascular diseminada) o bien con anti-coagulante oral circulante; hay que recordar que los anti-coagulante orales son anti-vitamina K dependientes => fII, fVII, fIX, fX por lo que se ve alterada la vía intrínseca, extrinseca y la vía común; el APTT en los pacientes que toman anti-coagulante es de 1,5-2 veces mas del valor normal.

Practica - Tiempo de Protrombina (TP/PT)
Fundamento - PT es el tiempo que tarda en coagular un PPP, cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hística; el reactivo en esta prueba es una mezcla de TH y Ca => tromboplastina cálcica; la TH procede de extractos de cerebro o de pulmón de hombre o de animales (conejo o vaca).
Material necesario - gradilla, 3 cubetas de coagulómetro (M,CNyCP), trocitos de acero especial para depositar en el interior de la cubeta, un rotulador de vidrio de punta fina, pipeta automática de 100 y 200 lambdas, puntas de pipeta automática adecuada, coagulómetro, baño maría a 37ºC, tubos de ensayo de plástico.
Reactivos - tromboplastina cálcica de la casa grifols, se reconstituye con 5 ml de agua destilada; se necesita 200 lambdas x 3 cubetas
Muestra - PPP correctamente preparado

Técnica - homogeneizar la tromboplastina cálcica hidratada suavemente; depositar el volumen total de tromboplastina cálcica que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado; atemperar la tromboplastina cálcica a 37ºC en un baño de agua a 37ºC entre 5-15 minutos; introducir un trocito de acero en cada cubeta de coagulómetro; rotular el extremo superior de las cubetas con M,CNyCP; pipeteamos en cada cubeta 200 lambdas de reactivo atemperado; metemos las cubeta en el pocillo calefactor de coagulómetro; apretamos 200 + start (teóricamente señala 120 segundos) y se pone en marcha el cronometro regresivo; cuando suena la alarma, metemos las cubetas (uno por uno) en la posición de lectura; tapamos con el capuchón y esperamos 5 segundos y pulsamos reset para poner al 0 el cronometro y añadimos 100 lambdas de plasma de manera enérgica.

Lectura de resultados - PT es el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica hasta la formación del coagulo de fibrina; el resultado también se expresa en forma de % de actividad de la protrombina => se interpola en la curva de actividad de la indice de Quick previamente preparada y se halla el % de actividad de la protrombina que le corresponde a este; ademas se puede expresar en forma de cociente o proporción (ratio) entre PT de la muestra y PT de CN no diluido (100% de actividad); VN del PT 11-13 segundos (70-100%); la ratio de protrombina normal (INR) => 0,9 - 1,5; en paciente que toman anti-coagulante es de 2-3.

Interpretable clínica - en pacientes que toman anti-coagulantes orales el indice de Quick normalmente 25-35% y el INR 2-3 (depende de la casa comercial); en estos casos ademas del Quick también es aconsejable hacer un APTT al inicio del tto y este APTT debe fluctuar entre 1,5-2 veces mas del VN; encontraremos  valores aumentado en T-Quick => en la enfermedad hemorragica del recién nacido, en la insuficiencia hepática, en la avitaminosis K, en el CID (coagulacion intravascular diseminada), anti-coagulante orales, y cuando haya deficiencia de algunos factores de complejo protrombinico (protrombinasa).

Practica - Preparación de una curva de actividad de la Protrombina
Fundamento - los resultados de PT se pueden expresar en forma de porcentaje de actividad (indice de Quick) => se prepara una curva de actividad de la protrombina y posteriormente interpolar en la gráfica trazada el valor en segundos del PT determinado en el plasma problema; para construir la curva => se prepara una batería de diluciones a partir de un plasma control normal, y se mide el PT del plasma control normal no diluido (se asigna 100%) y de cada una de las diluciones preparadas (con sus % correspondientes); con los datos de los resultados, se traza una curva de calibrado (de actividad de la protrombina) anotando en el eje de ordenadas/vertical el PT del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones; en el eje de abscisas/horizontal, el% de actividad asignado a cada uno de ellos.

Material - 8 tubos de ensayo de plástico, rotulador de vidrio de punta fina, pipeta automática (de 1000 lambdas y 50 lambdas) con sus puntas, 5 cubetas de coagulómetro, baño de agua a 37ºC, bolígrafo, regla, hoja de papel milimetrado (papel Quick-Graph), gradilla.
Reactivo - suero fisiológico o tampón de Michaelis; tromboplastina cálcica; plasma CN; a partir del plasma CN se prepara una batería de diluciones de la siguiente manera:

Técnica - homogeneizar la tromboplastina cálcica y las diluciones de plasma CN suavemente; depositar el volumen total de TH cálcica que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico (200 lambdas x 5 tubos => preparamos 1,5 ml); atemperar la TH cálcica a 37ºC en un baño de agua 5-15 minutos; introducir un trocito de acero en cada una de las 5 cubetas de coagulómetro; rotular el extremo superior de las cubetas con % que corresponde (100, 50, 33, 25 y 10); incubar 200 lambdas de reactivo durante 2 minutos en la placa calefactora del coagulómetro; marca 200+start => dejar el cronometro siga su regresión cuando llega a 0, suena la alarma, apretamos reset y añadimos de manera enérgica 100 lambdas del CN o de la dilución (se hace una por una); al agregar el CN, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de este; cuando se forma el coagulo, el coagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la TH cálcica.

Lectura de resultados - PT es el tiempo transcurrido desde la adición de la TH cálcica hasta la formación del coagulo de fibrina; con los datos de los resultados construimos la curva de calibrado o de referencia; se señalan en la gráfica los puntos en que confluyen cada uno de PT con su % de actividad correspondiente, se dibuja la linea que mejor une los 5 puntos; si la gráfica se traza en un papel milimetrado normal, se obtiene una curva; el indice de Quick normal para paciente que toman dicumarinos 25-35%.

Practica - Determinación Funcional de Fibrinógeno
Fundamento - el fibrinógeno plasmático puede ser cuantificado mediante diferentes métodos; sin embargo, se suelen utilizar aquellos que exploran sus capacidades funcionales o antigénicas; la determinación cronométrica de fibrinógeno, según el método de von Clauss, se basa en la medición del tiempo que tarda un exceso de trombina en degradar a fibrina el fibrinógeno presente en un PPP diluido y por tanto en formar un coagulo => depende exclusivamente de la cantidad inicial de fibrinógeno y es inversamente proporcional a la concentración de este en el plasma estudiado (fibrinogenemia); cuanto mas tiempo tarda, menos concentración fibrinogenemia; e.j.(1) 7" => 500 mg/dl; 5" => x mg/dl; x = 7/5 x 500 = 700 mg/dl;(2) 7" => 500 mg/dl; x" => 350; x = 7 x 500/350 = 10"

Material necesario - gradilla, 5 tubos de ensayo de plástico, pipeta automática 1000 lambdas y de 50 lambdas, puntas de pipeta automática, rotulador de vidrio de punta fina, 5 cubetas de coagulómetro, trocitos de acero, coagulómetro, bolígrafo, hoja de papel de tipo logarítmico o Fibri-Graph.
Reactivo - fibrinógeno-Kit de la casa Grifol => trombina bovina (viene liofilizado - hay que diluir con agua destilada); tampón de Owren para diluir plasma calibrador y la muestra; plasma calibrador o de referencia; agua destilada.
Muestra - PPP correctamente preparado

Técnica - homogeneizar los reactivos suavemente; diluir el plasma calibrador y la muestra de la manera que se indica en el siguiente cuadro; depositar el volumen total de trombina bovina que se va a necesitar, en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado (100 lambdas x 5 tubos = 500 lambdas => cogemos 700 lambdas para estar seguro); atemperar la trombina bovina a temperatura ambiente (20-25ºC); introducir un trocito de acero en las 5 cubetas de coagulómetro; rotular el extremo superior de 4 cubetas con (Cx2, C, C/2, C/3) y de otra cubeta con M; verter 200 lambdas de cada una de las diluciones de plasma calibrador y de la muestra en sus cubetas correspondientes; incubar las diluciones del plasma calibrador y la muestra, contenidas en las cubetas a 37ºC durante 2 minutos en la celda calefactora del coagulómetro; agregar 100 lambdas de trombina bovina; al agregar la trombina, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de este; cuando se forma el coagulo, el coagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la trombina.

Lectura de resultados - si el resultado final determinado en la muestra es < 7 segundos, la fibrinogenemia es muy alta, por lo que se ha de repetir la determinación, pero partiendo de una dilución de 1/20 (25 microlitro de muestra + 475 microlitro de tampón Owren) y el resultado nuevo se debe multiplicar por 2; si el resultado final es > 40 segundos, la fibrinogenemia es muy baja, por lo que se ha de repetir la determinación, partiendo de la dilución de 1/5 (50 lambdas de muestra + 200 lambdas de tampon Owren) y el resultado nuevo se debe dividir entre 2; para establecer la fibrinogenemia de la muestra se ha de trazar previamente en papel bilogaritmico una curva de referencia o de calibración; en el eje de ordenadas/vertical => el tiempo en segundos de coagulacion de cada una de las diluciones y en el eje de abscisas/horizontal => las concentraciones de fibrinógeno que corresponden; posteriormente, se señalan en la gráfica los puntos en que confluyen cada valor de tiempo de coagulacion con su fibrinogenemia correspondiente y se dibuja la recta que mejor une los 4 puntos; finalmente el valor en segundos del tiempo de coagulacion determinado en la muestra, se interpola en la curva de calibración, previamente preparada y se halla la concentración de fibrinógeno que le corresponde a este; VN de fibrinogenemia => 150-450 mg/dl.


Interpretación clínica - la formación de fibrinógeno y por tanto su concentración plasmática puede estar disminuida por trastornos congénitos (afibrinogenemia congénita) o adquiridos (hepatopatías) y también en trastornos como fibrinolisis patológica; la fibrinogenemia asciende de una forma in-especifica en procesos inflamatorios, debido a que es un reactante de fase aguda.

Pruebas que estudian la fibrinolisis

Pruebas globales
Tiempo de lisis de coagulo de sangre total (tiempo de Lee White)
Es el tiempo que tarda en lisarse, "in vitro", un coagulo formado a partir de sangre total; se mide situando un tubo de vidrio con sangre coagulada en un baño de agua a 37ºC, observando seguidamente a las 8, 24, 48 y 72 horas, el momento en el que se lisa el coagulo. La lisis del coagulo se aprecia como una disolucion del mismo, que conduce a la organización de la sangre en el tubo en 2 fases, una inferior constituida constituida por células y otra superior de naturaleza liquida. El tiempo de lisis del coagulo es el transcurrido desde el inicio de la incubación de la sangre coagulada hasta el momento en que se constata la destrucción del coagulo preexistente. Normalmente igual o superior a 72 horas; si es inferior => paciente padece probablemente un proceso de hiper-fibrinolisis.

Pruebas parciales
Cuantificación del fibrinógeno
La cuantificación del fibrinógeno circulante también es imprescindible cuando se pretende estudiar el estado de la fibrinolisis. Esto se debe, en primer lugar a que una baja concentración plasmática de fibrinógeno conduce a la formación de un coagulo pequeño y quebradizo, que no permite una adecuada medición del tiempo que arda este en lisarse. En segundo lugar, una caída brusca de la concentración plasmatica de fibrinógeno confirma la sospecha de la existencia de un proceso de hiper-fibrinolisis o síndrome de desfibrinación y CID sepsis, originado por meningococo gram (-) que causa hematoma.

Determinación de PDF
Los PDF pueden determinarse en suero, plasma y orina. Es preferible que la muestra sea un PPP, ya que pueden producirse interacciones entre el coagulo formado durante la obtención del suero y los PDF precoces. Los PDF se detectan mediante técnicas inmunológicas (inhibición de la hemaglutinación, aglutinación indirecta) que se basan en el enfrentamiento de los PDF contenido en la muestra con un reactivo a base de Ac específicamente dirigidos contra ellos. Una vez detectados los PDF, el calculo de la concentración a la que están presentes en la muestra se lleva a cabo mediante procedimientos semicuantitativos (determinando su titulo). La concentración normal de PDF en el plasma => 2-8 micro-gramos/ml; patológicos: > 10 micro-gramos/ml. Se encuentran concentraciones séricas excesivas de PDF en todos los síndromes de desfibrinación. Una prueba mas especifica consiste en la detección inmunologica de dímeros *D. Esta mayor especificidad se debe a que, mientras que la fibrinogenolisis genera PDF normales, la fibrinolisis origina también una cantidad apreciable de otros PDF que son los dímeros D. Por lo que, si se detecta un exceso de estos en el plasma, se deduce que se han formado coágulos de fibrina en el interior de los vasos, que posteriormente han sido degradados (típico de la coagulacion intravascular diseminada /CID y de la trombo-embolia venosa); la concentración normal de dímeros De en el plasma => 0,25 micro-gramos/ml.

Sistema diagnostica de los trastornos hemostáticos

Pruebas para el control de la terapia con anti-coagulantes
Los medicamentos utilizados para la terapia antitrombótica, actúan a diferentes niveles:

a)-Medicamentos para prevenir/inhibir la formación del coagulo de fibrina son los anti-coagulantes.

b)-Medicamentos que impiden la adhesión y agregación plaquetarias son los antiagregantes.
c)-Medicamentos trombolíticos, es decir, que rompen el coagulo de fibrina: son los fibrinolíticos.

a)-El tratamiento con anti-coagulantes requiere un control estrecho,  ya que la diferencia entre una dosis terapéutica, ineficaz o toxica es muy pequeña. Ademas existen variaciones interpersonales que no pueden preverse de forma estándar. El control de dicho tratamiento se efectúa en el laboratorio, no midiendo el nivel de fármaco administrado, sino midiendo su efecto mediante el alargamiento de algunas pruebas de coagulacion. El tipo de anti-coagulante administrado condiciona el tipo de prueba a realizar. La prueba ideal es aquella que depende de los factores de coagulacion afectados por el anti-coagulante, aunque en realidad no haya una prueba ideal.

a.1.)- Pruebas para el control de la terapia con heparina:
La heparina (y los anti-coagulantes orales), como ya se ha dicho, no disuelven el coagulo, pero impiden su formación o bien que se extienda. La heparina es un fármaco que no se absorbe vía intestinal, por lo que ha de ser administrada por vía parenteral (vía venosa-continua o intermitente o por vía subcutánea). Su mecanismo de actuación es a traves de la antitrombina III, bloqueando la activación de la trombina y también los factores VIIa, IXa, Xa, XIa y XIIa; heparina actúa como cofactor de AT-III (potenciar su mecanismo de acción)
Se utilizaran para su control aquellos test que exploren la vía intrínseca y común de la coagulacion.
- Prueba de lee White (ya no utilizada)
- PTT /aPTT: es la mejor prueba. Ha de estandarizarse para cada laboratorio como se ha comentado anteriormente. Se considera el PTT dentro del rango terapéutico cuando da valores entre 1,5 y 2 con respeto al valor control.
- Tiempo de Trombina: esta prueba permite valorar el tratamiento heparínico cuando se administran otros tipos de fármacos que puedan afectar a la coagulacion (e.j. los dicumarínicos), o que haya niveles alterados de los factores de la coagulacion por otras causas. Una vez establecida la terapia, el control debe ser diario. Si la terapia con heparina no es continua, sino que es intermitente, la prueba ha de hacerse 30 minutos antes de que se haya de administrar la siguiente dosis.

a.2.)- Pruebas a realizar en el tratamiento con anti-coagulantes dicumarínicos:
Son los anti-coagulantes orales o anti-vitaminas K. Se utilizan en la profilaxis y tratamiento de la trombosis. Su acción se debe al bloqueo de la síntesis hepatica de los factores vitamina K dependientes (II, VII, IX y X) y de las proteínas C y S que también son vitamina K dependientes (en realidad estos factores se forman, pero no son coagulantes y se les llama PIVKA). Se administran vía oral, absorbiéndose en el intestino y son transportados en sangre fundamentalmente por la albumina. Es importante saber que su acción antitrombótica tarda entre 1-3 días a partir del inicio del tratamiento, por lo que normalmente al inicio del tratamiento se combina su administración con heparina, suprimiéndose esta de manera gradual hasta que comienzan a actuar los dicumarínicos.
Las pruebas a realizar para este tipo de terapia pueden ser las que exploran la vía extrinseca y también la vía intrínseca de la coagulacion, aunque es mas sencilla y especifica la prueba que explora la vía extrinseca (T.de protrombina), ya que el factor VII es el que tiene menor vida media (4-6 horas) y es por tanto mas sensible:
- T. de protrombina o T. de Quick: los valores normales oscilaran entre un 25-35% la ratio, entre 2-4 y el INR entre 2-3 (para los pacientes que toman dicumarínicos.
- aPTT: los valores normales oscilaran entre un 1,5-2 veces el tiempo de valor control, aunque como no detecta el factor VII (que es entre los factores vitamina K dependiente sel de menor vida media), no se recomienda su uso.

b)- Tratamiento con antiagregantes
Los antiagregantes evitan la adhesión de las plaquetas al tejido subendotelial de los vasos, inhibiendo su agregación e impidiendo su desgranulación. Los fármacos aparecidos con esta función se utilizan fundamentalmente como preventivos de la trombosis arterial. Entre ellos el mas utilizado es el AAS (acido acetil salicílico), comercialmente llamado Aspirina, dado en pequeñas dosis (alrededor de 100 mgr diarios). Debido a su mecanismo de acción, prolonga el T. de sangría (Duke)

c)- tratamiento con fibrinolíticos
El objetivo de la terapia con fármacos fibrinolíticos es la activación del plasminógeno contenido en el trombo para su transformación en plasmina y así destruir la fibrina y por tanto, lisar el trombo. Los fármacos utilizados son la estreptokinasa y la urokinasa y sus derivados (llamados rTPA), y se utilizan sobre todo en el tratamiento precoz del infarto de miocardio, pues al intentar disolver el coagulo se evita la necrosis del musculo cardíaco.
Para hacer el seguimiento con esta terapia se utilizan varias pruebas:
- Tiempo de trombina (se deberá mantener entre 1,5-5 veces el tiempo de valor control)
- Medición de plasminógeno
Sobre todo:
- Determinación del fibrinógeno
- Determinación de los PDF


Inmunohematología - Banco de sangre I

En 1900 Karl Landsteiner, forense del Instituto de Anatomía Patológica Viena, descubre el sist. ABO.

Selección de los donantes
La selección de los donantes es un paso previo fundamental, dado el gran numero de enfermedad que se pueden transmitir vía sanguínea => historia clínica donde figuran los datos de identificación del donante, y una serie de preguntas sobre enfermedades padecidas, tratamientos en curso, vacunaciones, viajes a países tropicales, etc. para determinar si esa persona es aceptable o no como donante.

Se debe hacer un examen físico del donante => tensión arterial y pulso con valores normales y observación de su estado físico si hay signos de debilitamiento, desnutrición, anemia, ictericia, cianosis, disnea, inestabilidad mental o intoxicación por alcohol, drogas u otros productos.

Criterios de exclusión que se aplican a los donantes:
(1)- definitivamente => personas que padezcan bronquitis crónica, diabetes con tratamiento de insulina, enfermedades auto-inmune, enfermedad cardíaca y vascular, enfermedad de Creutzfelt/Jakob (la vaca loca), epilepsia, fiebre reumática con secuelas cardíacas crónicas, hipertensión, bebesiosis y leishmaniosis (parásitos), infección VIH y SIDA, enfermedades malignas, policitemia vera, nefritis crónica  pielonefritis.

(2)- temporalmente => mujeres embarazadas (hasta 9 meses después del parto y durante la lactancia), individuos alérgicos o que padecen asma leve, portadores heterocigóticos de beta-talasemia, cirugía mayor o menor (3-6 meses), fiebre >38ºC y síndrome gripal, antecedentes de ictericia o hepatitis pueden donar a criterio del medico responsable.

(3)- personas con periodo de cuarentena => brucelosis 2 años tras la recuperación completa; tuberculosis 2 años; osteomielitis 2 años; osteomielitis 2 años; glomerulonefritis aguda 5 años; malaria 3 años; en caso de enfermedad infecciosas, el medico responsable de la unidad de extracción establecerá la naturaleza de la exposición y el tiempo de rechazo.

(4)- otras exclusión temporal => personas vacunadas 48 horas y 3 meses si la inmunización de sueros animal; personas transfundidas de sangre o hemoderivados 1 año.

Requisitos que se pide a los donantes en el día de la donación:
- se encuentra bien y declara los medicamentos que se toma; examen físico
- tiene mas de 18 años y menos de 70 años
- pesa mas de 50 kgs (se extrae 450 ml => +/- 10% del peso corporal)
- intervalo mínimo entre donaciones estándar 2 meses (4 x al año para los varones y 3 x para mujeres) y 1 mes entre donación de sangre total y aferesis.
- el pulso debe ser regular (entre 50-110 pulsaciones/minuto); tensión arterial sistólica max 180 mm de Hg y diastólica max 100 mm de Hg; no debe estar hipotenso; temperatura oral max 37,5C; valores de Hb mínimos 12,5 g/dl en mujeres y 13,5 g/dl en varones; beber abundante cantidad de agua y no beber alcohol pasta 6 horas después de la donación.

Pruebas de comprobación analítica de la sangre (establecidas por el consejo de Europea)
1- Grupo ABO y Rh (tipificación de la sangre)
2- Determinación Acs anti-HIV 1 y 2 => debe ser negativo
3- Determinación de Ags de hepatitis B (HBsAg) => debe ser negativo
4- Determinación de Acs anti-hepatitis B => debe ser negativo
5- Determinación de Acs anti-hepatitis C (VHC) => debe ser negativo
6- Detección de reaginas (Acs) para la sífilis => debe ser negativo
7- Detección de Acs anti-citomegalovirus (CMV) => debe ser negativo
8- Detección de Acs anti-virus linfotrópico de células T humanas (HTLV) => debe ser negativo
9- Detección de alanina amino-transferasa (GPT) => debe ser dentro de los valores normales
10- Hb mínimo 45g/unidad (se analizan 4 unidades al mes)
11- Hemólisis al final de la conservación => debe ser < 0,8%

Banco de sangre II

Extracción de sangre total:
- Se utiliza triple bolsas de extracción con aguja y anti-coagulante incorporado (para hacer aferesis de los diferentes componentes)
- Anti-coagulante => citrato sódico con sustancias conservantes (mantener viabilidad de los hematíes durante 12 días => así, se puede establecer el periodo de caducidad en 42 días)
- Mezclas de anti-coagulante => CPD-adenina (ácido cítrico, citrato sódico, fosfato sódico y dextrosa) o CPD-SAG-manitol (solución salina, adenina y glucosa)
- El volumen de sangre extraído no bebe superar lo 450 ml => controlado por una balanza digital con plataforma (sistema de balanceo para mezclar suavemente la sangre permitiendo que se mezcle) que de forma automática se produce el pinzamiento del tubo colector al alcanzar el peso de sangre deseado, finalizando así la extracción.
- Se le hace un bucle, se puede cortar y hacer de ella la sangre para hacer los grupos y dispensar las en diferentes tubos para hacer las pruebas.

Extracción de hemoderivados
- Para obtener alguno de los componentes de la sangre (técnica de aféresis) => separar los distintos componentes de la sangre para obtener los hemoderivados; citaféresis => separación celular; eritraféresis => separación de eritrocitos; leucoféresis => separación de leucocitos; plaquetaféresis => separación de plaquetas (cuando la plaquetaféresis se hace manual, se utilizan las plaquetas de 6 donantes diferentes, se meten en la misma bolsa con un poco de plasma y se mantienen en agitación continua a 22ºC durante max 5 días a partir de las cuales pierden su actividad; cuando la extracción se hace en automática, se utilizan las plaquetas del mismo donante); plasmaféresis => cuando se desea coger solo plasma.
- Existen aparatos que realizan la aféresis automáticamente => separando los componentes necesarios y devolviendo el resto al donante; ventajas => rapidez y condiciones optimas de asepsia; desventajas => el elevado coste de aparataje, se necesita personal especializado para manipularlo y ademas dura 60 minutos.
- Mas frecuentemente la separación se realiza a partir de bolsas de sangre total con bolsas satélite incorporadas que recogen el componente que nos interesa sin perder la esterilidad => la primera bolsa con CPD se centrifuga quedando separadas sus componentes (abajo los hematíes, en medio los leucocitos + plaquetas y arriba el plasma); mediante un sistema de prensado, el plasma se recoge en una bolsa, los hematíes en otra y los leucocitos + plaquetas con un poquito de plasma se quedan en la primera bolsa.

Componentes sanguíneos
Sangre total:
- Extraída de un donante adecuado y recogida en una bolsa estéril y libre de pirógenos (microbios) => contiene un anti-coagulante apropiado (CPD-A); mantiene todas sus propiedades durante un periodo de tiempo limitado; se produce un rápido deterioro de los leucocitos de las plaquetas y de algunos factores de la coagulación (sobre todo F.VIII).
- Transporte => a una temperatura entre 2-6ºC; para la preparación de plaquetas debe ser mantenida a 20ºC mediante placas de butanodiol.
- Almacenamiento => a temperatura entre 2-6ºC; si el anticoagulante es CPD-A se conserva max 35 días
- Indicaciones => déficit de glóbulos rojos y déficit de volumen sanguíneo

Concentrado de hematíes:
- Se obtiene mediante la separación  del plasma de la sangre total, tras la sedimentación espontanea de los hematíes o la centrifugación de la sangre total y también mediante un procedimiento de aféresis.
- Transporte => a una temperatura 2-6ºC
- Almacenamiento => a temperatura entre 2-6ºC max 35 días
- Indicaciones => la reposición de hematíes en casos de perdida de sangre; el tratamiento de las anemias.
- Contra-indicaciones => aloinmunización contra Ags leucocitarios; intolerancia al plasma.

Hematíes lavados:
- Es una suspensión de hematíes obtenida a partir de una unidad de sangre total tras la separación del plasma y el lavado con una solución isotonica; objetivo => eliminar Acs que hayan en el superficie de los hematíes.
- Preparación => se centrifuga la sangre total y se separa el plasma y la capa leucoplaquetaria; se procesa mediante la adición secuencial de solución salina isotónica (a +4ºC) y centrifugación.
- Transporte => a una temperatura 2-6 ºC
- Almacenamiento => a temperatura entre 2-6ºC; si la preparación se ha llevado a cabo a temperatura ambiente, el periodo de conservación  es de 6 horas como máximo y si se prepara a +4ºC, el periodo de conservación es de 24 horas como máximo.
- Indicaciones => sustitución o reposición de glóbulos rojos en pacientes con Acs a proteínas plasmaticas, especialmente anti-IgA; sustitución o reposición de glóbulos rojos en pacientes que han mostrado reacciones alérgicas graves asociadas a la transfusión de productos sanguíneos.

Plaquetas:
- Un concentrado de plaquetas se obtiene a partir de sangre total mediante centrifugación de plasma rico en plaquetas o a partir de la capa leucoplaquetaria; para obtener una unidad estándar de plaquetas (manualmente) se debe partir de 4-6 unidades de sangre total; la concentración de plaquetas en este componente ha de estar entre 45-85 x 10(9) plaquetas por 50-70 ml de plasma; el anticoagulante -conservante mas apropiado para las plaquetas es SAG-manitol.
- Transporte => a temperatura igual que en el almacenamiento
- Almacenamiento => a temperatura de 22ºC (+/- 2 ºC); garantizar la disponibilidad de oxigeno a las plaquetas (bolsas permeables a los gases); las plaquetas deben ser sometidas a una agitación suficientemente eficaz y delicada; un volumen de plasma suficiente para garantizar pH entre 6,5-7,4; no se almacena mas de 5 días.
- Indicaciones => trombocitopenia grave con hemorragias importantes y déficit de plaquetas (<50.000).

Plaquetas - aféresis
- Es un concentrado de plaquetas obtenido por aféresis, a partir de un donante unico, utilizando un equipo automatizado de separación celular; una unidad estándar de plaquetas, lograda por aféresis equivale a las plaquetas obtenidas a partir de 5 o mas unidades de sangre total; la maquina de aféresis extrae sangre total del pacientes, recoge las plaquetas y devuelve los restantes componentes sanguíneos al donante; el proceso de aféresis incluye un paso adicional de centrifugación o filtración para reducir el numero de leucocitos contaminantes.
- Transporte => a la misma temperatura que el almacenamiento
- Almacenamiento => a una temperatura de 22ºC (+/- 2ºC); se debe garantizar la disponibilidad de O2 a las plaquetas (bolsas suficientemente permeables a los gases); las plaquetas deben ser sometidas a una agitación suficientemente eficaz y delicada; un volumen de plasma suficiente para garantizar pH entre 6,5-7,4; no se almacena mas de 5 días.
- Indicaciones => trombocitopenia grave con hemorragias importantes y déficit de plaquetas; con la aféresis se reduce el riesgo de aloinmunización HLA y el riesgo de transmisión viral al disminuir el numero de donantes por unidad de plaquetas a 1.

Plasma fresco congelado
- Se obtiene (se separa) a partir de sangre total mediante centrifugación intensa o de un PRP, antes de las 6 horas desde la extracción y nunca tras 18horas; debe contener los niveles normales de albumina, inmunoglobulinas, factores de la coagulacion estables; también ha de contener como mínimo 70% de factor VIII y otros factores lábiles de la coagulacion; también se puede obtener plasma mediante procedimiento de aféresis que dura 45' y con el se logra el equivalente a lo obtenido a partir de 3 unidades de sangre; la congelación del plasma se debe realizar en 1 hora a una temperatura < -30ºC.
- Transporte => mantener la temperatura de almacenamiento
- Almacenamiento => es estable: 24 meses a < -40ºC; 12 meses => entre -30ºC y -40ºC; 6 meses => entre -25ºC y -30ºC; 3 meses =J> entre 18ºC y -25ºC.
- Indicaciones => alteración de la coagulacion sobre todo, cuando existe un déficit multiple de factores; tratamiento de la purpura trombótica trombocitopénica (PTT); grandes quemados; como materia prima para el fraccionamiento de los factores de coagulacion.

Crioprecipitado:
- Es la fracción crioglobulínica del plasma con una porción importante de factor VIII-C, factor Von Willebrand, fibrinógeno, Factor XIII y fibronectina; se obtiene a partir de plasma fresco congelado que se deja descongelar lentamente, a temperatura de 2-6ºC, después se centrifuga y se recoge el Crioprecipitado con 7-10 ml de plasma sobrenadante; el producto obtenido se vuelve a congelar.
- Transporte => mantener la temperatura de almacenamiento.
- Almacenamiento =>  es estable: 24 meses a < -40ºC; 12 meses => entre -30ºC y -40ºC; 6 meses => entre -25ºC y -30ºC; 3 meses =J> entre 18ºC y -25ºC.
- Indicaciones => coagulacion intravascular diseminada (CID), defectos del fibrinógeno; carencia de factor VIII.

Granulocitos:
- Es un componente compuesto por granulocitos suspendidos en plasma; se prepara mediante maquinas separadoras de células (leucoféresis) tras ser obtenidos deben ser sometidos a una dosis adecuada de radiación ionizante;
- Transporte => mantener la temperatura de almacenamiento
- Almacenamiento => no es apto para su almacenamiento y ha de ser transfundido lo antes posible, tas su recogida; si es inevitable, debe estar máximo 24 horas a 22+/-2ºC
- Indicaciones => pacientes con neutropenia severa y sepsis (inmunodeficiencia)

Células progenitoras hematopoyéticas (CPH)
- Son células pluripotentes /células madres (stemcells) con capacidad de auto-renovación, diferenciación y maduración hacia todas las estirpes hematopoyéticas (en laboratorio especiales).
- Se encuentra entre => las células de la MO; las células mononucleares de la sangre circulante /LUC; las células de la sangre del cordón  umbilical.
- Se reconocen por => formar colonias en cultivos celulares in vitro y poseer el marcador de membrana CD34.
- Pueden proceder de =>
(1)- propio paciente (trasplante autólogo) mediante técnicas de reducción/ eliminación de la contaminación por células malignas; es necesaria la criopreservación que se realiza de siguiente manera:
- las células a trasplantar se suspenden en un medio proteico (una mezcla de plasma autólogo y albumina) que contiene el criopreotector; la suspensión de CPH se guarda en criobolsas y se congela en un dispositivo de nitrógeno liquido, en fase de vapor; a la hora de ser usados, se descongelan en un baño con agua a 37ºC y se transfunden inmediatamente.

(2)- donante apropiado (trasplante alógeno) => selección del donante tras tipaje completo HLA; someter el producto a técnicas de reducción/ eliminación de la contaminación por linfocitos T (minimizar el rechazo); se obtiene a partir de:
- aspiración MO, se filtra para retirar los fragmentos de hueso y se centrifuga para recoger una capa leucoplaquetaria de la que se aíslan las CPH;
- sangre periférica => el donante ha de ser tratado previamente con factores de crecimiento y las CPH son recogidas, como células mononucleares, mediante citaféresis;
- cordón umbilical => se recogen como células mononucleares, a partir de sangre procedente de la vena del cordón umbilical.

Almacenamiento => congelación entre los -80 y los -196ºC
Transporte => a una temperatura < -120ºC en un recipiente adecuado que contenga, claramente legible, la dirección del receptor del producto y las siguientes etiquetas: no pasar por rayos X; mantener congelado; material lábil de trasplante humano único, transporte urgente.
Indicaciones => aplasia del tejido hematopoyético debida a patología primaria; una dosis elevada de quimioterapia y/o radioterapia; leucemias.

Tipaje de la sangre y hemoderivados
- Son fundamentales la determinación del grupo ABO, Rh, prueba de Coombs directo y detección de Ac irregulares para reducir al máximo las reacciones post-transfusionales por incompatibilidad sanguínea entre donante y receptor.
Pruebas a hacer a todas las bolsas de sangre:
1. Grupo ABO, Ags he maticos y Acs plasmáticos y de grupos sanguíneos menores (se hace en paneles)
2. Determinación del grupo Rh con fenotipo completo (el mas importante es anti-A y anti-B al 1/50 por debajo se puede donar).
3.a. Titulo de hemolisinas /Ac con capacidad de hemólisis a los donantes del grupo O.
3.b. Titulación de aglutininas anti -A y anti-B a los donantes del grupo O.
4. Serología de lúes / sífilis, hepatitis B, C, VIH, CMV, GPT.
5. Hemograma completo y un estándar de Bioquímica  => glucosa, urea, creatinina.
6. Escrutinio de Ac irregulares (EAI) en el receptor (Rh grupo menor).
7. Pruebas cruzadas (PPCC) mayor => enfrentar hematíes del donante con suero del receptor

PPC menor => enfrentar hematíes del receptor con plasma del donante (el contrario).

Inmunohematología y grupos sanguíneos

Inmunohematología - parte de la hematología que se ocupa de las reacciones inmunológicas relacionadas con todos los componentes de la sangre.

Alo Ac => Acs que reconocen Ags que no pertenecen al individuo que los ha producido

Auto-Ac => Acs que reaccionan contra Ags propios
Iso Ac => Acs que reaccionan con Ags de los que carece el sujeto

Iso Ag => Ags que los poseen todos los individuos de la misma especie (Agh)

Alo Ag => Ags que solo los poseen algunos individuos (AgA o AgB del sistema ABO)

Antígeno (Ag) o inmunógeno - moleculas de gran tamaño capaces de inducir una respuesta inmune, pudiendo reaccionar con los Ac formados; generalmente de estructura proteica o glucoproteica, con varios epítopes o fragmentos que son reconocidos por los Acs.
Anticuerpo (Ac) o inmunoglobulinas - glucoproteínas que forma el organismo como respuesta al contacto con un Ag y que reaccionan específicamente contra el; en la electroforesis migran junto a otras globulinas; formadas por 4 cadenas polipeptídica (2 ligeras y 2 pesadas) unidas entre si por enlaces covalentes y puentes disulfuro intercatenarios; las variaciones (isotípicas) de las cadenas pesadas dan lugar a los 5 tipos de Ig (IgG - IgM - IgA - IgD - IgE); también hay 2 isotipos de cadena ligeras Kappa y Lambda que pueden estar asociadas a cualquiera de los isotipos de las cadenas pesadas; los Ac se sintetiza en el linfocitos B que al entrar en contacto con el Ag se activan transformándose en células plasmaticas (productoras de Ac).

Reacción Ag-Ac => Ac en contacto con Ag (in vivo o in vitro) => forma el complejo Ag-Ac (una unión no covalente y reversible) => hemólisis y aglutinación.
Hemólisis => destrucción de los hematíes por la unión de Ag con Ac en presencia del complemento (sangre roja => rosada)
Aglutinación => agrupamiento de una suspensión de partículas al reaccionar el Ag presente en la superficie de estas con sus Ac específicos; in vivo estas partículas son hematíes; in vitro pueden ser hematíes o partículas inertes (sangre roja => se forman grupitos / grumitos)

Grupos sanguineos - conjunto de sustancias de naturaleza proteínica compleja que se encuentran, fundamentalmente, en la membrana de las células hemáticas con carácter antigénico => existen Ac contra ellos; cada individuo posee unos determinados Ags que le son transmitidos genéticamente según las leyes de Mendel; sistema de grupo sanguíneo son alotípicos (propios de un grupo de individuos dentro de una especie, permanecen estables y constantes toda la vida); su importancia en medicina legal => identificar o excluir a un individuo en pruebas de paternidad y en actos delictivos con manchas de sangre o secreciones (saliva y semen).
Los Acs capaces de reaccionar con estos Ags son de procedencias natural o adquirida por inmunidad; Ac naturales => inmunoglobulinas que aparecen independientemente de cualquier tipo de estimulación y generalmente son IgM (aglutininas completas por su gran tamaño no atraviesan la barrera placentaria); Los IgM que reaccionan entre 4-20ºC tienen escasa importancia clínica, pero también las hay que reaccionan a 37ºC que pueden ocasionar complicaciones (e.j. IgM anti-A o anti-B).
Ac inmunes => aparecen después de una estimulación antigenica, y suelen ser IgG (aglutininas incompletas o bloqueantes, de menor tamaño y atraviesan sin dificultad la barrera placentaria, no provocan hemólisis / aglutinación.
Ac completos IgM => son multivalentes, capaces de formar puentes entre 2 o mas hematíes para dar lugar a la aglutinación, también son capaces de fijar al complemento con lo que también puede provocar hemólisis intravascular;
Ac incompletos IgG => son bivalentes y solo son bloqueantes, no generan hemólisis intravascular rápida como los completos, sino que es extra vascular, destruyendo los hematíes sensibilizados en el bazo y higado por el sistema mononuclear fagocítico.

Grupos sanguíneos eritrocitarios
Ags eritrocitarios - la mayor parte están presentes en la membrana de los hematíes (mosaico fluido compuesto por doble capa lipídica donde se insertan proteínas globulares de tamaño variable; algunos están sintetizados por células mucosas en forma de glucoproteínas se encuentran en el plasma y secreciones; cada uno de estos Ags eritrocitarios es producto de un gen, expresado directamente (sistema Rh) o indirectamente (sistema ABO).

Acs eritrocitarios - suelen ser del tipo IgG e IgM y alguna vez IgA y son de procedencia natural o adquirida; hetero Acs => proceden otras especies animales o vegetales; alo Acs => proceden de la misma especie pero de distintos individuos; Iso Acs => Acs que reaccionan con Ags de los que carece el sujeto; Auto Acs => Acs que reaccionan con Ags presentes en los propios hematíes del individuo; Acs regulares => presentes siempre aunque no existe el Ags correspondiente; Acs irregulares => no siempre se encuentran en ausencia del Ags; Acs aglutinantes (completos) => no hace falta modificar el medio in vitro para que se produzca la aglutinación; Acs sensibilizantes/ bloqueantes (incompletos) => se necesita modificar el potencial zeta eritrocitario para que puedan aglutinar;

Patologías relacionadas con los grupos sanguíneos eritrocitarios - los principales son:
- Reacciones hemolíticas postransfusionales => se producen al reaccionar los Acs presentes en el suero del receptor con los Ags de los hematíes del donante; pueden ser inmediata o retardada y según su gravedad => hemolítica moderada o cuadro de shock con fracaso renal;
- Enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) => una inmunización de la madre frente a los hematíes del feto; puede ocurre en el curso de un embarazo, parto, o aborto; los Acs (IgG) son capaces de atravesar la barrera placentaria y producen hemólisis en el feto con mayor o menor gravedad clinica según la intensidad de la inmunización.
- Anemia hemolítica autoinmune => el individuo genera Acs frente a sus propios Ags de la membrana de sus propios hematíes que produce hemólisis.

Grupos sanguíneos leucocitarios
son grupo de molécula (proteínas) con carácter antigénico que se encuentran en la superficie de los leucocitos; no se determinan en la practica diaria transfusional, pero si en los trasplantes de órganos y tejidos y en las pruebas de identificación de individuos (pruebas de paternidad).

Ags leucocitarios - algunos están presentes en la membrana leucocitaria y otros en células y tejidos (conforman el sistema HLA - Human Leucocyte Antigens o Ags de histocompatibilidad); su síntesis esta codificada por genes que se encuentran en el brazo corto de cromosoma 6; es muy importante para realizar un trasplante de tejidos=> los injertos de tejido HLA idénticos son aceptados con mayor facilidad y requieren menor cantidad de fármacos inmunosupresores para impedir el rechazo; existe 3 clases:
- Moléculas de clase I: glucoproteínas localizadas en la membrana plasmática de todas las células nucleadas del organismo (excepto las del sistema nervioso) => se domina A, B, C.
- Moléculas de clase II: glucoproteínas formadas por 2 cadenas alfa y beta unidas de mono no covalente localizadas en la membrana celular de los linfocitos B, monocitos y precursores eritrocitarios => se domina seri D: DP, DQ, DR.
- Moléculas de clase III: proteínas que forman parte del sistema del complemento => C4, C2 y factor B.

Grupos sanguíneos plaquetarios - Ags presentes en la membrana de las plaquetas; pertenecientes al sistema HLA; los mas importantes => PLA, PLE, Ko, DUZO y Bak.

Sistema ABO

Descubierto por Karl Landsteiner en 1900.
Distribución geográfica del grupo ABO => España O-47%, A-40%, B-8%, AB-5%; en la raza blanca predominante A-44%, O-43%, B-9%, AB-4%; en la raza negra O-48%, A-27%, B-21%, Ab-4%.

Ags del sistema ABO (Ag A + Ag B) - están ampliamente distribuidos no solo en los  hematíes sino también en las células epiteliales, secreciones, endoteliales; establecen 4 grupos sanguíneos (uno de ellos, ambos o ninguno); determinada genéticamente y se hereda según las leyes de Mendel; su síntesis esta codificada por genes ABO en el cromosoma 9 => existe genotipo AA, AB, BB, AO, BO, OO que origina fenotipos de grupo sanguíneo A, B, AB, O.

Grupo sanguíneo ABO comienzan a formarse en el 3er mes de gestación, pero no adquieren su plena competencia inmunógena hasta los 18-22 semanas tras el parto, esto se debe a que en numero de veces que se replica el Ags en la membrana del hematíe, al principio es reducido y luego va aumentando hasta repetirse 1 millón de veces; los Acs no se encuentran totalmente desarrollados en el recién nacido; los Acs naturales aparecen a los 2/3 meses del nacimiento, estando totalmente establecidos aproximadamente hacia los 10 años.

Estos genes productores de Ag están relacionados con el sistema Hh con 2 alelos; el gen H es mas frecuente (esta situado en la cromosoma 19) en la población mundial y el gen h, amorfo o nulo. En la membrana de los hematíes existen 2 sustancias precursoras => la I y II; la sustancia II (cadenas de oligosacáridos) independientes o que forman parte de las glucoproteínas/ glucolípidos de los hematíes es la sustancia precursora sobre la que actuaran los genes que conforman sistema ABO. Los genotipos HH y Hh son capaces de sintetizar una enzima transferasas, formando así la sustancia H; su relación con sistema ABO =>
- El gen A codifica la síntesis de otra enzima transferasa + sust. H => se transforma en sust. A (Ag A)
- El gen B codifica la síntesis de otra transferasa + sustancia H => se transforma en sustancia B (Ag B)
- El gen O es amorfo/ nulo no codifica transferasas y no altera la estructura de la sustancia H.
Resumen => existen moleculas de glucolípidos sobre la membrana de los hematíes que tienen una cadena de oligosacáridos en su superficie (sustancia II); según cual sea el azucar en su extremo terminal tendremos sustancia H, sustancia A o sustancia B; tener en cuenta que no toda la sustancia H se transforma en A o B, por lo que siempre encontraremos sustancia H en los hematíes; por tanto, existen sustancias en hematíes H, HyA, HyB, HAyB => grupo sanguíneo O, A, B y AB.

Los individuos con genotipo hh (nulo) son incapaces de producir sustancia H; sus hematíes carecen de Ags del sistema ABO aunque en su dotación genética existe los genes A y B => grupo Bombay (1er sitio donde se descubrió); este grupo tiene una frecuencia muy baja; estos individuos tienen Acs anti-H, anti-A y anti-B de modo natural; los Acs de este grupo son muy activos a 37º y hemolisan cualquier hematíes que no sean del grupo Bombay (solo se transfunden de su grupo).

El gen A tiene 2 alelos A1 y A2 => 80% de las personas del grupo A son A1 y 20% son A2; existen mas variación del gen A y también hay variación del gen B (A1, A2, Ax, Am); el grupo AB también tienen 2 sub grupos (A1B y A2B); hay que tener cuidado con A2B porque a su vez como el Ag A2 es débil  podemos catalogar-les como solo del grupo B.

Sistema secretor - existe un gen secretor (Se) que da lugar a las mismas sustancias antigénicas que hay en los hematíes; los individuos con genotipo SeSe y Sese (80%) presentaran sustancias H, A y/o B en las secreciones (semen o saliva); los homocigotos sese (el gen se es nulo /amorfo) no las tendrán; este sistema es importante cuando la detección del grupo sérico y hemático no es concluyente.

Acs del sistema ABO - son Acs naturales (no puede precisarse que Ag lo desencadena); son regulares (aparecen siempre); actúan entre los 4-37ºC y son capaces de activar al complemento y de provocar hemólisis intravascular al primer contacto; otros sistemas de grupo sanguíneo debe producirse una inmunización previa, por embarazo o transfusión, para que se formen en el organismo los Acs frente a los nuevos Ags; los Acs del sistema ABO suelen ser del tipo IgG e IgM (el IgG sobre todo se encuentran de manera natural en el grupo O y puede provocar enfermedades hemolítica del recién nacido (HRN) por incompatibilidad materna-fetal de madre grupo O con hijos de grupo A, B o AB); IgG => bivalente, bloqueante, temperatura optima de reacción 37ºC, atraviesa la placenta; IgM => multivalentes, aglutinante, temperatura optima de reacción 4ºC, no atraviesa la placenta.

Ademas de estos Ac, se puede encontrar un Ac anti-H en los individuos de los grupos A1, b o A1B; pero es un Ac débil y tiene poca significación clínica; si es importante el Ac anti-H que en los del grupo Bombay, ya que puede dar lugar a hemólisis y aglutinación eritrocitaria (son muy activos a 37ºC); en las personas del grupo O se encuentra Acs anti-A1B, anti-A y anti-B individualizados => son muy útiles para detectar Ags A y B débiles. Ac anti-A1 se encuentra 1-2% de los individuos A2 y en un 25% delos individuos A2B (normalmente no tiene significación clínica).

Practica LV - Determinación celular en porta
Fundamento - la detección celular del grupo ABO mediante una tecnica en porta; los hematies problema, que contienen sustancias antigénicas (aglutinogenos) del sistema ABO, se enfrentan con anti-sueros (algutininas) dirigidos contra esos Ags; el resultado final consiste en la aglutinacion directa de los eritrocitos cuando reaccionan contra el anti-suero que les corresponde; es importante mencionar que todas estas determinación deben hacerse a temperatura ambiente, ya que la aplicacion de calor puede afectar a los hematíes impidiendo observar una posible aglutinación; observaremos la aglutinación de los hematíes enfrentados a una serie de anti-sueros conocidos y de reconocida eficacia para determinar el grupo ABO del individuo.

Material - portaobjetos o tarjeta visualizadora de fondo blanco; rotulador de vidrio; pipeta pasteur desechable; palillos mezcladores; un reloj; reactivos => suero anti-A (azul); suero anti-B (amarillo); suero anti-AB (transparente); suero anti-A1/anti-H (transparente); albumina bovina como control negativo; muestra => sangre capilar o venosa anti-coagulada con EDTA.

Técnica - dividir 2 portaobjetos en dos secciones cada uno con el rotulador de vidrio, marcar letra A, en otra con letra B, siguiente con letra AB y al final con letra A1/H; depositar una gota de cada suero en cada secciones correspondientes; situar una pequeña gota de sangre (la mitad del volumen usado de anti-suero  junto a la gota de anti-suero; mezclar ambas gotas en cada sección utilizando un palillo distinto den cada una de ellas, formando un circulo de 2-2,5 cm de diámetro; hacer oscilar suavemente el portaobjetos hacia delante y hacia detrás durante unos segundos, observa la presencia o ausencia de aglutinación.

Lectura de resultados - hay aglutinación cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un liquido claro; en el caso contrario, los hematíes permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo; la presencia o ausencia de aglutinación puede confirmarse mediante examen microscópico de las mezclas;

Practica LVI - Determinación celular en tubo
Fundamento - los hematíes problema contienen las sustancias antigénicas del sistema ABO y se enfrentan a sueros conocidos que poseen Acs frente a esos Ags; el resultado final es la presencia o no de aglutinación en los hematíes reaccionantes.

Material - tubos de centrifuga / hemólisis, rotulador de vidrio, pipetas Pasteur, centrifuga, gradillas; reactivos => suero anti-A, anti-B, anti-AB, anti-A1/H, albumina bovina como control (albumina + hematíes => negativo = no debe aglutinarse); muestra => sangre total anti-coagulada (botón de hematíes)

Técnica - lavado de los hematíes problema => en cada uno de los 4 tubos verter 3 gotas de la muestra de sangre (150 lambdas) + solución salina para completar el tubo, agitar y centrifugar 1' a 3000 rpm, decantamos el sobrenadante (repetir 3x); a los hematíes de los tubos añadimos solución salida para obtener una suspensión al 2% o dejarlos como un botón de hematíes; rotular 4 tubos de ensayo con letras A, B, AB y A1/H; añadir a cada tubo 2 gotas de suero anti-A en el tubo A, 2 gotas de anti-B en el tubo B, 2 gotas de anti-AB en el tubo AB y 2 gotas de anti-A1/H en el tubo A1/H; centrifugar 1' a 1000 rpm o 30" a 3.400 rpm (centrifuga de inmunohematología).

Lectura de resultados - después de centrifugar, golpeamos suavemente el fondo de cada tubo para desprender el sedimento y observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación; reacción negativa => los hematíes se re-suspenden homogeneamente; reacción positiva => se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.

Interpretación clínica de los resultados - 2 fenómenos que se pueden evitar con el lavado previo de los hematíes problema: aglutinación no especifica => se debe a la presencia de acido hialurónico en la sangre, procedente de la gelatina de Wharton del cordón umbilical, y se elimina añadiendo una gota de hialuronidasa a la suspensión de hematíes; fenómeno de Rouleaux => agrupación no especifica de hematíes que adoptan una imagen de pilas de monedas; las sustancias que mas frecuentemente originan este fenómeno => el fibrinógeno, las gammaglobulinas, el dextrano y la polivinilpirrolidona.

Sistema Rh

Se descubrió 40 años mas tarde que el sistema ABO por 2 investigaciones independientes => por un lado Levine y Stetson en 1939 y mas tarde por Landsteiner y Wiener en 1940 que trabajaron con los monos; el 1er Ag humano del sistema Rh que se descubrió es el D; los individuos que poseen este Ag en la superficie de los hematíes => Rh+ y aquellos que no lo poseen => Rh-; existen 2 teorías acerca de la herencia del sistema Rh:

Teoría de Fisher-Race (inglesa) - Fisher, trabajando con los datos serológicos de Race, postulo la existencia de 3 locus/loci muy cercanos entre si en el cromosoma 1 que se transmiten conjuntamente; estos locus se denominaron D, C y E y cada uno de ellos tiene 1 alelo denominado d, e y e; el gen en cada locus da lugar a la producción de un Ag en la superficie del hematíe; el gen d es silencioso o nulo y no da lugar a la formación de ningún Ag (no se ha encontrado el Ac contra el Ag d); genotipo de DCE/dce => fenotipo (Ag) de DCE/ce;

Nomenclatura del sistema Rh de Fisher-Race - 3 loci del cromosoma => D, C y E y sus alelos => d, c y e; en cada gen hay 2 posibles alelos => Dd, Cc, Ee; sin embargo, al referirnos a su fenotipo (los Ags presentes en los hematíes), no se menciona la letra d, ya que es un gen nulo que no da lugar a ningún Ag; el Ag D es el mas antigénico de los 5, luego C (20x menos que el D), E, e, c; ejemplos :
Genotipo DCe/dce => fenotipo DCcee => Rh+
Genotipo dCE/dCE => fenotipo CECE => Rh-

Teoría de Wiener (americana) - Wiener propuso un modelo genético diferente, en el que, en lugar de existir 3 loci separados, hay una sola región genética en el cromosoma 1 con muchos alelos codominantes; alelo => una forma de gen que ocupa el mismo locus/ lugar en un determinado cromosoma => genes gemelos que proviene 1 de madre y otra del padre , ocupa el mismo lugar en cada cromosoma; cada uno de estos alelos es responsable de la producción de un Ag en la superficie del hematíe, que a su vez posee varios determinantes antigénicas reconocidos por Acs específicos.

Ags del sistema Rh - no esta bien definido su proceso de formación, parece ser que sobre una sustancia precursora, actuarían las enzimas controlado genéticamente, que darían lugar a los Ag del sistema; se considera que son lipoproteína presentes en la membrana eritrocitaria y puede participar en el funcionamiento de esta membrana, ya que los individuos que no poseen Ags Rh en los hematíes presentan anemia hemolítica por fragilidad de los eritrocitos; estos Ags no aparecen en otras células o secreciones; la complejidad del sistema Rh => gran polimorfismo de sus Ags (múltiples variantes de los Ags correspondientes a los locus D, C y E; la mayoría de estas variantes son muy poco frecuentes; los que tienen interés en la practica clínica:

Ag Du - es un alelo débil del Ag D, que se pone manifiesto usando Ac anti-D mas potentes que los habituales o mediante técnicas que facilitan la aglutinación de los  hematíes previamente sensibilizados (prueba de Coombs); importante => un donante Du+ puede sensibilizar a un receptor D-; si no se detecta en la sangre del donante, la clasificaremos erróneamente como Rh negativo; a todos Rh- hay que hacer prueba de Coombs, para asegurar si tiene Ag Du que se comporta como Rh- => como donante actúa Rh+, como receptor actúa Rh-, así que hay que donarle siempre Rh-, si no se producirá Ac anti-D.

Ags D parciales - Ag D es un mosaico de subunidades que se encuentra presente en su totalidad o ausente si el paciente es Rh-; en ocasiones, una persona es D positivo, pero le falta alguna parte de ese mosaico => se inmuniza contra esa parte en caso de recibir una transfusión o por contacto feto-materno => se producirán Acs capaces de reaccionar contra los hematíes del donante y dará falsa impresión de auto-anticuerpo anti-D.

Ac del sistema Rh - a diferencia del sistema ABO, los Acs que se producen frente a los Ags del sistema Rh son de carácter inmune (necesita una estimulación revia para su aparición en la sangre) por transfusión o por contacto feto-materno; suelen ser tipo IgG y se emplea para su detección la prueba de la anti-globulina humana (test de Coombs) debido a que reaccionan mejor en medio albuminoso; también se emplea enzimas, como la papaina, ficina y tripsina para favorecer la aglutinación de los hematíes con los anti-sueros anti-Rh; Ag con mayor poder inmunógeno es el D y encontraremos con mayor frecuencia el Ac anti-D, aunque también tienen importancia los otros Acs (Ac anti-e suele estar implicado en la mayor parte de los casos de anemia hemolítica autoinmune).

Practica LIX - Determinación del grupo Rh en porta
Fundamento - podemos determinar el grupo Rh tanto en porta como en tubo; en la prueba en porta, la aglutinación se favorece por el calor, de manera que es necesario disponer de un visualizador que permita tanto calentar el porta como observar mejor el resultado de la reacción (porque IgG reacciona en una temperatura 37ºC); la técnica esta basada en la detección del Ag D sobre la superficie de los hematíes problema, empleando como reactivo un suero monoclonal humano que contiene Acs anti-D; en el caso de que los hematíes contengan el Ag D, se producirá una aglutinación que puede observarse a simple vista;

Material - portaobjetos, pipetas Pasteur, rotulador de vidrio, palillos agitadores, visualizador luminoso; reactivos => suero anti-D, albumina bovina al 30% como control negativo; muestra => sangre total anti-coagulada con EDTA.

Técnica - dividir el portaobjetos en 2 secciones con el rotulador de vidrio y marcar una con letra S (suero) y otra con letra A (albumina); en la sección S colocamos 1 gota del suero anti-D, y en la sección A ponemos 1 gota de albumina bovina; depositamos 1 gota de sangre en cada una de las secciones y mezclamos con palillos distintos; colocamos el porta sobre el visualizador previamente calentado, y lo balanceamos para favorecer la mezcla de sangre y reactivos;

Lectura de resultados - esperamos unos segundos antes de dar el resultado de la prueba; aglutinación positiva => aparición de grumos rojos sobre un fondo claro (no confundir con pequeños coágulos de fibrina presentes en la muestra / puntitos finos); aglutinación negativa => la mezcla da lugar a una suspensión homogenea de los hematíes; la mezcla de sangre con albumina bovina debe dar siempre aglutinación negativa.

Practica LX - Determinación del grupo Rh en tubo
Fundamento - para esta técnica, empleamos unos sueros anti-D que pueden ser de 2 tipos: salino o albuminoideo (son mas utilizados - preparados en medio enriquecido con albumina) porque favorece aglutinación  los hematíes pueden revestirse in vivo de Ac o proteínas plasmáticas anormales y en presencia de albumina producir una agregación que daría la idea de una aglutinación positiva; por ello empleamos un control de albumina, de manera que si aparece aglutinación en este tubo debemos repetir la prueba, pero usando un suero anti-D en medio salio o haciendo lavado de hematíes; intentamos poner de manifiesto la presencia del Ag D en la superficie de los hematíes mediante su enfrentamiento a un suero anti-D;

Material - tubo de hemólisis, rotulador de vidrio, gradilla, pipetas Pasteur, centrifuga; reactivos => suero anti-D, albumina bovina al 30%, solución salina fisiológica (0,9%); muestra => suspensión de hematíes o botón de hematíes preparado (que se obtiene a traves de lavado de hematíes)

Técnica - rotulamos 2 tubos limpios con letras D y A; en el tubo D añadimos 2 gotas de suero anti-D y el tubo A ponemos 2 gotas de albumina bovina al 30%; a cada tubo le añadimos 1 gota de la suspensión de hematíes a 5% o el botón de hematíes; se agita suavemente para mezclar; centrifuga 1' a 3000 rpm o 30" a 3.500 rpm.

Lectura de resultados - con el pulpejo de los dedos medio y anular golpeamos suavemente el fondo de los tubos para despegar el botón hemático; se considera aglutinación positiva si se forman grumos de color rojo en un liquido claro; por el contrario, si se re-suspenden homogéneamente los hematíes, decimos que la aglutinación es negativa; el tubo con albumina es un control negativo => debe dar siempre ausencia de aglutinación, sino la prueba no es valido.

Interpretación clínica de los resultados obtenidos - si el tubo D presenta aglutinación y el tubo A no, decimos que el paciente es Rh positivo; si no se produce aglutinación en ninguno de los dos tubos procedemos a incubar ambos a 37ºC durante media hora; posteriormente centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto y observamos si existe o no aglutinación; en el caso de persistir negativo, comprobaremos que el paciente no posee un Du (D débil) mediante la prueba de Coombs indirecta); después de todos estos pasos, si el resultado es la no aglutinación, informaremos que el paciente es Rh-.

Practica LXII - Determinación de un Du
Introducción - en algunos casos, los Acs tipo IgG (incompletos) son incapaces de producir la aglutinación de los hematíes por si solos; pero si, de adherirse a su superficie tanto in vivo como in vitro y decimos que han sensibilizado a los hematíes; también son capaces de fijar el complemento, sin llegar a producir la hemólisis de los eritrocitos; estos Acs tipo IgG pueden reaccionar con un suero de conejo en el que existen Acs anti-globulina humana del tipo IgM (completos); el resultado de esta reacción es una aglutinación de los hematíes; este suero anti-globulina humana es lo que llamamos suero de Coombs, puede ser de 2 tipos:
- poliespecífico => si esta dirigido contra la IgG y contra el componente C3d del complemento.
- monoespecífico => si esta dirigido solo contra la IgG o solo contra alguno de los componentes del complemento;
La prueba de Coombs o de la anti-globulina humana puede realizarse de 2 modos:
- prueba directa => intentamos detectar Acs incompletos que han sensibilizado a los hematíes in vivo; para esto los enfrentamos directamente al suero de Coombs y observamos si existe o no, aglutinación;
- prueba indirecta (PAI) => se realiza el paso previo (la sensibilización) de los eritrocitos in vitro, para posteriormente hacerlos reaccionar con  el suero de Coombs; buscamos Acs incompletos libres en el suero o poner de manifiesto la presencia de Ags débiles en la membrana de los hematíes

Fundamento - el Du es un Ag D débil que no pone de manifiesto en las pruebas normales de determinación de Rh; por ello debemos sensibilizar previamente los hematíes problema con un suero que contiene Acs anti-D y posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs; si existe el Ag Du en la superficie de los eritrocitos, se producirá la unión de los Acs anti-D a sus receptores de membrana y en la segunda fase darán lugar a la aglutinación en presencia del suero anti-globulina humana (es una prueba de Coombs indirecta)

Material - tubo de hemólisis, centrifuga, pipetas Pasteur, gradilla, baño de agua, reloj; reactivos => suero anti-D humano, suero anti-globulina humana de conejo (suero de Coombs) - color verde, solución salina fisiológica; muestra => hematíes de sangre problema previamente lavados 3 x en solución salina fisiológica y suspendidos al 5% en dicha solución o botón de hematíes.

Técnica - en tubo de hemólisis colocamos 2 gota de suero anti-D y 1 gota de botón de hematíes; mezclamos suavemente e incubamos a 37ºC durante 30'-45'; después de incubar, lavamos los hematíes en solución salina fisiológica 3x consecutivas; añadimos sobre el sedimento hemático 2 gotas de suero de Coombs y mezclamos suavemente; centrifugar el tubo 1000 rpm durante 1'.

Lectura de resultados - observamos la aparición o no de aglutinación, mediante golpes suaves en el fondo del tubo; en caso de duda, observamos al microscopio entre porta y cubre con el objetivo de 40x;

Interpretación clínica de los resultados obtenidos - si existe aglutinación, el resultado es +, indica que en la membrana de los hematíes hay Ag Du y se clasifica la sangre como Rh+ variante Du; en el caso de no existir aglutinación se clasificara la sangre como Rh-;

Otros sistemas de grupo sanguíneo

Se conocen mas de 600 Ags agrupados en 21 sistemas / grupos, la mayoría de estos grupos se encuentran en todas las personas, aunque hay algunos que solo existe en algunas personas; estos Ags, eritrocitarios o no, capaces de producir Acs específicos que tienen cierta importancia en las reacciones transfusionales.

Sistema Kell - Estos Ags están presentes en un gran numero de personas de raza blanca y aquellos individuos que no poseen ninguno de sus Ags suelen presentar anomalías morfológicas acompañadas de anemia hemolítica en bajo grado; los Acs son capaces de producir la enfermedad hemolítica del recién nacido;

Sistema Duffy - los genes de este sistema se encuentran localizadas en el cromosoma 1; su presencia en los individuos negros se ha relacionado con su resistencia natural a contraer el paludismo; esto parece indicar que los Ags del sistema Duffy son los receptores para el plasmodium o que al menos contribuyen a la infección; los Acs que se forman contra los antígenos del sistema Duffy tienen poco interés transfusional, ya que los Ags tienen poco poder inmunógeno;

Sistema Lutheran

Sistema Kidd

Sistema MNSs - se considera que este sistema consta de 2 loci en el cromosoma, y posee cuatro alelos => M, N, S y s que tienen interés transfusional y su importancia radica en su relación con la estructura de la membrana eritrocitaria; los Acs formados contra los Ags de este sistema pueden ser naturales o inmunes; los mas interesantes son los anti-M inmunes, que son del tipo IgM y a 37ºC pueden activarse dando lugar a reacciones transfusionales; son muy poco frecuentes en la población;

Sistema Lewis - fue descubierto 1946 y esta muy relacionados con sistema ABO; sus Ags tienen la misma sustancia precursora tipo I del sistema ABO en las secreciones, ya que en la formación de los Ag de este sistema, interviene el gen secretor Se del sistema ABO; los Ags de este sistema no se encuentran en la membrana del hematíe por ser sintetizados en los precursores hemáticos, sino que están en el plasma y de ahí se incorporan a la membrana eritrocitaria; también encontramos sustancias de este sistema en la saliva aunque su composición bioquímica no es exactamente igual; los Acs anti-Lewis pueden ser naturales que actúan a 22ºC (tipo IgM por ello no atraviesan la placenta) y no intervienen en las reacciones transfusionales; sin embargo, si existen algunos activos a 37ºC que pueden tener poder hemolizante.

Sistema Ii - el interés de estos Ags no es transfusional, sino que se ha observado un aumento del Ag i en hemopatías malignas, acompañado de una disminución del Ag I.

Sistema P - tienen poco interés transfusional

Sistema Xg => el único interés en que su gen se encuentra localizado en el cromosoma X.

Practica LXIII - Detección de Acs irregulares
Introducción - Acs irregulares => se producen  frente a Ags distintos a los del sistema ABO; generalmente aparecen por una inmunización, transfusional o fetomaterna y pueden producir reacciones postransfusionales; la identificación de los Acs irregulares es de gran importancia en el diagnostico y tratamiento de la enfermedad hemolítica del recién nacido y de ciertos trastornos hemáticos, así como en la prevención de reacciones transfusionales y en estudios durante el embarazo; la detección de los Acs se realiza enfrentando el suero del paciente a una serie de hematíes tipado (como reactivos), de los cuales se conocen con exactitud los Ags presentes en su membrana; el resultado positivo => la aglutinación de los hematíes; se puede llevar a cabo mediante 3 tipos de tecnicas: test de Coombs indirecto; técnica enzimática; técnica a 4ºC;
- Test de Coombs indirecto => incubación previa del suero y los hematíes tipados para conseguir la sensibilización de estos hematíes, es decir que los Acs presentes en el suero se adhieran a la superficie eritrocitaria; posteriormente se añade el suero de Coombs (antiglobulina humana) para poner de manifiesto la presencia o no de esos Acs mediante la aglutinación de los hematíes.
- Técnica enzimática => tratar previamente los hematíes tipados con una enzima, para facilitar la aglutinación de los hematíes; se suelen emplear la tripsina, papaina, ficina o bromelina (porque agrupa a los otros Ags de los hematíes y disminuye la carga (-) superficial de los mismos).
- Técnica a 4ºC (detectar las crioaglutininas o Acs que reaccionan mejor a baja temperatura) => incubar el suero y los hematíes a 4ºC para posteriormente centrifugar y observar la presencia o no de aglutinación;
Se recomienda utilizar al menos 2 de estas técnicas para obtener buenos resultados en la detección de Acs irregulares.

Metódica - la técnica se desarrolla con el empleo de un panel de hematíes humanos pertenecientes a una casa comercial (no tenemos); el panel de hematíes consiste en una suspensión al 0,8% de hematíes de grupo O tanto +como-, procedentes de 11 donantes distintos; estos hematíes difieren en su configuración antigénica y son elegidos para contribuir a la identificación de la mayoría de Acs con significación clínica que aparecen con mas frecuencia; un Ac reaccionara de forma especifica con el antígeno dque estimulo su producción; de esta manera, el Ac podrá identificarse según su esquema de reactividad frente a un panel de eritrocitos de configuración antigénica conocida; mediante un test de Coombs indirecta pondremos en evidencia la existencia o no de Acs irregulares en el suero del paciente.

Como se hará en clase:
Material - tubos de hemólisis, gradilla, rotulador de vidrio, centrifuga, micropipeta, pipeta de Pasteur, baño de agua; reactivos => sangre/botón hematies O Rh+ lavados; sangre/botón de hematíes del paciente Rh- para autocontrol, solución salina fisiológica al 0,9% (SSF); muestra => plasma/suero fresco (PR) Rh- procedente de sangre anticoagulada  con EDTA;

Técnica - lavar los hematíes del paciente (Rh-) y obtener un botón para el tubo autocontrol; rotular el tubo PR y dispensar 1 gota (50 lambdas) de hematíes Rh+ lavados; añadir 2 gotas del suero/plasma PR al tubo PR y 2 gotas al autocontrol; incubar 60' a 37ºC en baño de agua; lavar 3x con SSF y dejar el botón (en cada tubo); añadir 1 gota de suero de Coombs; centrifugar 1' a 1000 rpm.

Lectura de resultados - con el pulpejo de los dedos, soltar el botón y observar la presencia o no de aglutinación; el autocontrol ha de ser siempre (-).

Reacciones transfusionales

Terapia transfusional /transfusión sanguínea - implica riesgo a pesar de las precauciones que se toman, aun existe la posibilidad de efectos indeseables que en algunos casos son fatales; normalmente en la transfusión se utilizan los componentes sanguíneos obtenidos mediante fraccionamiento, para disminuir el riesgo de reacciones adversas debido a la presencia de Acs del donante o por sobrecarga circulatoria; una transfusión sanguínea esta indicada cuando Hb es < de 8 g/dl o HCT es < o = al 20%.

Componentes sanguíneos:
- concentrado de hematíes
- concentrado de plaquetas
- plasma fresco congelado
- crioprecipitado
- albumina y fracción proteica del plasma (FPP)
- otros hemoderivados (los factores de coagulacion) => F VIII, F IX, Inmunoglobulinas, Antitrombina III y Fibrinógeno

Administración del hemoderivado - medidas de seguridad imprescindibles:
- Comprobar la identidad del paciente => preguntar al paciente su nombre y fecha de nacimiento o leyendo datos en la pulsera identificativa que lleva.
- Comprobar la coincidencia entre el grupo sanguíneo del paciente y el indicado en la etiqueta de la unidad de sangre.
- Comprobar que la fecha de caducidad de la unidad de sangre  no ha sido excedida.
- La transfusión rápida de sangre fría puede ser en si misma peligrosa, por lo que se debe controlar cualquier aparato destinado a calentar la sangre.
- No debe añadirse ningún fármaco o solución terapéutica a la sangre, a menos que se haya demostrado que la adición no produce daños en los componentes sanguíneos. No deben añadirse a la sangre soluciones de calcio o glucosa concentrada.
Una vez comprobados estos datos, el ATS que realiza la transfusión tomara las constantes vitales del paciente y procederá a la transfusión, observando al paciente durante los primeros 5-10 minutos, por si aparecen reacciones adversas; la duración normal es de 90 minutos; un sistema de transfusión no debe utilizarse > de 6 horas; todos los hemoderivados se deben administrar con filtros que retienen los macroagregados;

Reacciones transfusionales - efectos no deseables que pueden aparecer en el paciente durante o después de la transfusión; suelen manifestarse con dolor de espalda, escalofríos, fiebre, dificultades respiratorias, hipotensión e incluso shock; implican una suspensión de la transfusión y una comprobación de la compatibilidad y la ausencia de contaminación bacteriana; pueden ser inmediatas o retardadas (después de días, semanas o meses de la transfusión); pueden ser inmunológicas o no inmunológicas:

Reacciones inmunológicas:
- Reacciones hemolíticas (error importante de grupos sanguíneos) => hemólisis o destrucción de los hematíes del donante por los Acs del receptor; la gravedad mas o menos según el tipo de Acs; el mas grave cursa con hemólisis intravascular, producida por incompatibilidad del sistema ABO (identificación incorrecta); aparece de forma inmediata (basta con pocos ml para que aparezcan los sintomas del shock transfusional) => sensación de quemadura en la vena de perfusión, dolor lumbar (de los riñones), cefaleas, escalofríos, hipotensión y taquicardia; los Acs responsables suelen ser anti-A, anti-B y anti-AB; en otros casos, la hemólisis aparece al cabo de unos días de la transfusión (escalofríos, fiebre y anemia) originado por Acs que aparecen después de la transfusión, con una posible inmunización previa por embarazos o transfusiones anteriores;
- Reacciones febriles, no hemolíticas (se evita con concentración de hematíes) => se manifiesta con hipertermia y escalofríos, suelen intervenir Acs anti-leucocitos y anti-plaquetarios;
- Reacciones alérgicas => urticaria (picor, escozor) originado por Acs frente a las proteínas plasmáticas del donante; aparecen de forma inmediata durante la transfusión y no suelen ser graves; se evita administrando anti histamínicos antes o durante la transfusión;
- Reacciones anafilácticas (se evita transfundiendo concentrado de hematíes lavados, totalmente libres de plasma) => aparecen en raras ocasiones y de forma inmediata; ocurre en pacientes con deficiencia congénita de IgA y que poseen Acs anti-IgA; al administrarle plasma que contiene IgA, desarrollan una reacción anafiláctica muy grave que puede ser mortal;

Reacciones no inmunológicas:
- Septicemia => por contaminación del hemoderivado durante el almacenamiento; es mas frecuente en los concentrados de plaquetas (por mantenerse a 22ºC para conservar su viabilidad); puede ocasionar shock endotoxémico que se manifiesta con sensación de frió, cefaleas, dolor abdominal, vómitos y diarreas;  es una complicación grave que exige tratamiento con antibióticos endovenosa inmediato;
- Transmisión de enfermedades => es imposible descartar el riesgo de transmisión de ciertas enfermedades: Hepatitis C con un riesgo post-transfusional de 0,5-1%; Hepatitis B 0,2%; VIH 0,2%, Sífilis casi nulo; Citomegalovirus el riesgo se reduce a los pacientes inmunodeprimidos o transplantados; virus de Epstein-Barr no tiene demasiada importancia clínica (evolucionar espontáneamente hacia la curación); plasmodium muy escasa.
- Sobrecarga circulatoria => una expansión del volumen sanguíneo rapida y de larga duración; aparece en pacientes con alteración cardiológicas en los que se transfunde demasiado volumen o en muy poco tiempo; puede causar insuficiencia cardíaca y edema pulmonar;
- Hemosiderosis => acumulación de grandes cantidades de Fe en pacientes politransfundidos; en estos pacientes se aconseja el empleo de quelantes férricos como la desferroxiamina  y limitar el numero de transfusiones al mínimo;
- Complicaciones por transfusión masiva => aparecen en pacientes a os que se administra mas de 10 unidades de sangre en 24 horas;
- Embolia producida por burbujas de aire => se puede producir si el que efectúa la transfusión no es suficientemente cuidadoso y hábil (presencia de aire en las venas a traves del sistema del goteo por negligencia);

Auto-transfusión - refundir cualquier componente sanguíneo al mismo individuo que, previamente, lo había donado siempre que haya previsión de una intervención de un paciente aparentemente sano, cuando la situación lo permita.

Practica LXIV - Prueba cruzada mayor
Introducción - el objetivo de las pruebas pre-transfusionales es detectar las posibles reacciones Ag-Ac entre la sangre del donante y del receptor, antes de la transfusión; por ello es imprescindible realizar una serie de determinaciones:
1. Tipaje correcta del grupo ABo y Rh del donante y del receptor => se intenta transfundir sangre del mismo grupo del receptor y si no es posible, se usara una sangre compatible (O-).
2. Escrutinio de los Acs irregulares en el receptor => si se detectan Acs irregulares, deberían ser identificados para administrar sangre que carezca de los Ags correspondientes; no es imprescindible realizar esta determinación en la sangre del donante, ya que el volumen de plasma transfundido es pequeño en comparación con el plasma del receptor, pero si es conveniente hacerla par evitar todo tipo de riesgo;
3. Prueba cruzada mayor => determinar la incompatibilidad entre la sangre enfrentando el suero del receptor con los hematíes del donante;
Otras pruebas que también pueden realizarse => la prueba cruzada menor (enfrentar el suero del donante con los hematíes del receptor) y un autocontrol, donde se buscan auto-Acs mediante el enfrentamiento entre el suero del receptor y sus propios hematíes; la prueba cruzada menor solo se realiza cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso, la presencia de Acs en la sangre del donante puede ser peligrosa; el empleo de concentrados de hematíes hace innecesaria la realización de esta prueba; todas las pruebas deben realizarse en medio salio y en medio albuminoso para detectar todos los Acs presentes;

Fundamento - enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por ultimo frente al suero antiglobulina de Coombs; con este ultimo paso detectaremos los Acs que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria; es importante respetar los tiempos de incubación par evitar posibles errores en la técnica;

Material - tubos de hemólisis, centrifuga, baño de agua, pipetas Pasteur, gradilla, reloj; reactivos => SSF, albumina bovina al 30% (facilitar la aglutinación de los hematíes porque disminuye el potencial zeta y proporciona...), suero antiglobulina de Coombs; muestra => suero del receptor, obtenido de sangre coagulada y libre de hemólisis; debe ser fresco (menos de 24 horas) y conservado a 4ºC; hematíes del donante previamente lavados 3x en SSF y re-suspendidos o dejarlos como un botón de hematíes;

Técnica - en un tubo de hemólisis, depositar 1 gota del botón hematies del donante y 2 gotas del suero del receptor, mezclamos suavemente, y dejamos a temperatura ambiente 2'-3', centrifugar 3.500 rpm durante 30", leemos el resultado obtenido en medio salino (si es + paramos); añadir al tubo 3 gotas de albumina bovina al 30%, mezclar bien e incubar a 37ºC durante 30'-45'; centrifugamos a 3.500 rpm durante 30" y leer el resultado obtenido en medio albuminoso (si es + paramos); lavamos 3x los hematíes con solución salina para eliminar los Acs que no se han fijado a los eritrocitos, retirar bien todo el sobrenadante del ultimo lavado; añadir la tubo 1 gota del suero antiglobulina humana de Coombs, mezclar bien y centrifugamos a 1000 rpm durante 2", leemos el resultado;

Lectura de resultados - la lectura de los resultados se realiza re-suspendiendo el botón hemático con suavidad después de cada una de las centrifugaciones; en caso de reacciones débiles positivas, conviene observa al microscopio entre porta y cubre con objetivo de 40x.

Interpretación clínica de los resultados obtenidos - la ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles y por tanto, la transfusión es posible; la aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad; si se observa hemólisis en cualquiera de los pasos, también es signo de incompatibilidad (color rosado);

Anemias inmunohemolíticas

Anemia hemolítica autoinmune (anemia inmunohemolítica) - un grupo de enfermedades, causadas por la formación de auto Acs contra los propios eritrocitos del paciente; están dentro de las enfermedades autoinmunes; 2 tipos de Acs posibles:
- Acs calientes => actúan a la temperatura normal 37ºC del organismo y suelen ser de tipo IgG
- Acs fríos => actúan a bajas temperaturas de 0-10ºC, y suelen ser del tipo IgM

Anemia inmunohemolítica por Acs calientes - es mas común en mujeres adultas y en ancianos; se manifiesta con anemia leve crónica y esplenomegalia; existe varios tipos de enfermedades:
- Idiopática => manifestación primaria de causa desconocida
- Secundaria => aparece en 25% de los pacientes como una manifestación secundaria de una enfermedad que afecta al sistema inmunitario, las mas frecuentes son la leucemia linfocítica crónica (LLC), el linfoma de tipo no Hodgkin y el lupus eritematoso sistémico (LES).
- Inducida por fármacos => se produce en pacientes sometidos a terapia con ciertos fármacos (3 tipos)
1. fármacos que inducen la formación de Acs calientes por una deficiencia de linfocitos T supresores (alfa metildopa)
2. fármacos que se adhieren a la superficie de los eritrocitos, induciendo la formación de Acs contra ese complejo fármaco-eritrocito (penicilina)
3. fármacos que forman un complejo con las proteínas del plasma contra el cual se forman los Acs; la unión del complejo proteínas-fármaco-Acs se realiza en la superficie de los eritrocitos y es la causa de su hemólisis (quinidina)

Anemia inmunohemolítica por Acs fríos - las aglutininas frías producen 2 enfermedades clínicas distintas:
- la enfermedad de las hemaglutininas frías (EHF) => la mas común
- la hemoglobinuria paroxística fría (HPF)

Practica LXV - Test de Coombs directo
Introducción - esta técnica pone de manifiesto la presencia de Acs completos o incompletos, fijados a la membrana eritrocitaria que causa la hemólisis "in vivo"; esta indicada siempre que se sospeche que la causa de la hemólisis obedece a un mecanismo inmune: anemia hemolítica autoinmune, medicamentosa, enfermedad hemolítica del recién nacido o reacción hemolítica postransfusional; es importante saber que tipo de Ac es el que se ha fijado a la membrana eritrocitaria, IgG o IgM o si a causa es la presencia de complemento; por ello no se utiliza un suero antiglobulina de Coombs polivalente, sino sueros especificos: suero anti-IgG y suero anti-C3-C4; dado que los Acs IgM actual en frió, no se suele usar suero anti-IgM en esta técnica; existen técnicas especificas para su determinación

Fundamento - enfrentar los hematíes del paciente al suero de Coombs especifico para determinar si existen o no auto-Acs fijados en la membrana eritrocitaria; su presencia se manifiesta por la aglutinación de los  hematíes en el fondo del tubo; es importante realizar el control del suero de Coombs con hematíes previamente preparados, esto nos permitirá saber en que condiciones se encuentra y si los resultados obtenidos son validos.

Material - tubos de hemólisis, centrifuga, pipetas Pasteur, baño de agua, gradilla, rotulador de vidrio; reactivos => SSF, suero de Coombs, suero anti-D incompleto (no tenemos); botón de hematíes Rh- que actuaran como control (-); botón de hematíes Rh+ que actuaran como control (+) cuando las sensibilicemos con suero anti-D; muestra => hematíes del paciente lavados 3 veces con SSF (botón)

Técnica:
a)- preparación del control (-) => lavar la sangre Rh- 3x con SSF para obtener botón
b)- preparación del control (+) => lavar la sangre Rh+ 3x con SSF para obtener botón; añadir 2 gotas de anti D incompleto e incubar 1 hora a 37ºC, luego lavar 3x con SSF para obtener el botón sensibilizado
c)- preparación de los PR => ja lo hemos hecho previamente
Rotulamos los 3 tubos de hemólisis con las letras C(-), C(+) y PR; en el tubo C(-), añadir al botón 1 gota de suero de Coombs; ídem para el tubo C(+) y PR; centrifugar todos los tubos 45" a 3000 rpm

Lectura de resultados - tras la centrifugación, golpear suavemente con el pulpejo de los dedos para despegar el botón; los tubos de PR que presenten aglutinación => resultado (+), es decir indica presencia de Acs sobre la membrana eritrocitaria; el tubo C(-) siempre ha de ser (-) y el C(+), siempre ha de dar (+); si no es así, los resultados no son validos.